一种高效cik细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体地说是一种通过添加IL-1、IL-2、IFN-丫、CD3 AK、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量、所培 育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌化la细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高调亡率的高效CIK细胞 培养方法。
【背景技术】
[0002] 随着细胞生物学技术、临床医疗技术的研究深入和发展，进一步推动了细胞培养 技术迅速发展，然而对自体免疫细胞的培养研究有限，从而限制了免疫细胞治疗各类疾病 的技术发展和应用。
[0003] 细胞因子诱导的杀伤细胞（切tokine-In化ced Killer, CIK)是一种新型的免疫 活性细胞，CIK细胞增殖能力及细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。作为一种新型的、高 效的、非MHC限制性的免疫活性细胞得到了广泛应用。CIK细胞的实质和来源是指CD3+、 CD56+的淋己细胞，存在于正常人体中，但含量较少，约占5% W下。目前国内外用于临床的 CIK细胞制品，就是在体外倍增出的W该些细胞为主的细胞群。 随着生物医学技术的发展，CIK细胞已在临床大量应用，疗效也得到一定程度的认可， 为进一步提高CIK细胞的增殖能力及细胞杀伤能力，人们正逐渐寻求和改进CIK细胞的 体外培养和处理办法。有研究者在培养基中加入植物血凝素，刺激T细胞增殖。为了使体 内CD3+、CD56+及CD8+细胞等明显增多，有学者用重组的MVC-1病毒疫苗刺激淋己细胞 获得无人白细胞抗原限制性的杀伤性T淋己细胞。还有研究者应用基因工程技术对CIK 细胞的修饰，即转基因CIK细胞，在CIK细胞上转染含有IL-2、I k7、IL-24、共刺激分子 如B7分子家族、细胞黏附分子和LFA23等基因，可W使CIK细胞在体内不断增殖，使血 清中某些细胞因子水平增高，而提高效应细胞的作用。
[0004] 现在很多研究人员和机构采用的CIK培养方法效率较低，从70-100ml新鲜血液中 提取的外周血单个核细胞细胞，诱导培养约14天后细胞数量仅达到1〇9数量级。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种高效的CIK细胞体外培养的方法，具体地说是一种通过添加 比-1、IL-2、IFN-丫、CD3 AK、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最 终获取的细胞数量、所培育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌化la细胞及骨髓瘤Sp20细胞最 高调亡率的高效CIK细胞培养方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用W下技术方案： 一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为： 第一步；单核细胞分离 将定量血样装到离屯、管中，对血样进行离屯、，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐 水稀释，可缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋己细胞分离液的离屯、管中，进行离屯、后， 吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离屯、管中，向离屯、管内加入生理盐水，混合均匀，得 到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离 屯、处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水 离屯、后，弃去上清后，得到细胞沉淀； 第二步：接种培养瓶 取血样容积5%-10%的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样 容积25%-35%的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积 30%-60%的TCM-199培养基清洗离屯、管，清洗后，将洗漆液倒入T175培养瓶中； 向T175培养瓶中分别加入肥阳S-化、比-2、比-24、IFN-丫后，将培养瓶放入 C0,培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-UCD3 AK、EGF ;第4天，向培养瓶内添加胎 M. 牛血清及血样容积75%-80%的TCM-199培养基；第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的 TCM-199培养基； 第=步；接种培养袋 在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养 基洗漆培养瓶后，将洗漆液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样 容积15-18倍，同时添加EGF和IL-24,用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋 放入C0;培养箱中培养； 第四步：收取细胞 在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内 的细胞并放入生物安全柜中，用舰伏对剪刀W及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋 出液管，将细胞培养液经离屯、后，弃去上清，获得CIK细胞。
[0007] 本发明所述￡0戍f养箱的培养环境均为37°C、7. 5%。本发明所述第二步中加入的 肥阳S-化、比-2、比-24、IFN-丫、比-UCD3 AK、EGF浓度范围均在9-11 ng/ml。本发明所 述第二步加入的胎牛血清为血样容积的5%-10%。本发明所述第一步用生理盐水稀释血细胞 时，稀释比例为1:1。本发明将培养瓶内细胞倒入培养袋时，可将注射器套筒插入进液管作 为漏斗。本发明所使用的生理盐水采用一般医用生理盐水即可。
[0008] 本发明通过在培养过程中添加IL-1、比-2、IL-24、IFN-丫、CD3 AK、EGF等，诱导 外周血单个核细胞成为CIK细胞，并且在体外高效扩增。培养10天可W使初始细胞数量为 2:<106的外周血单个核细胞细胞诱导后扩增为的CIK细胞。在很大程度上提高了 CIK细胞的扩增数量和速度。不需要额外添加其他试剂和细胞诱导及增殖相关的细胞因子。 可有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量同时，所培育CIK细胞与普 通CIK细胞相比，可大幅增加子宫颈癌化la细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高调亡率。
【附图说明】
[0009] 图1是诱导后CIK细胞图片。
[0010] 图2是高效CIK培养方法流式细胞术鉴定结果。
[0011] 图3是CIK细胞对子宫颈癌化la细胞调亡的影响。
[0012] 图4是CIK细胞对骨髓瘤Sp20细胞调亡的影响。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合采用常用CIK细胞培养方法和本发明所使用的高效CIK细胞培养方法所 之间的对比实验对本发明作进一步的说明： 一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为： 第一步；单核细胞分离 将定量血样装到离屯、管中，对血样进行离屯、，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐 水稀释，生理盐水采用一般医用生理盐水即可，缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋己 细胞分离液的离屯、管中，进行离屯、后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离屯、管中，向 离屯、管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容 积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离屯、处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重 悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离屯、后，弃去上清后，得到细胞沉淀； 第二步：接种培养瓶 取血样容积5%-10%的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的 TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30%-60%的TCM-199培养基清洗离 屯、管，清洗后，将洗漆液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入肥PES-化、比-2、 比-24、IFN-丫后，将培养瓶放入￡0片音养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加比-UCD3 AK、 m EGF ;第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的TCM-199培养基，第5天，向 培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基； 第=步；接种培养袋 在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养 基洗漆培养瓶后，将洗漆液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样 容积15-18倍，同时添加EGF和IL-24,用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋 放入CO:培养箱中培养； 第四步：收取细胞 在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内 的细胞并放入生物安全柜中，用舰伏对剪刀W及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋 出液管，将细胞培养液经离屯、后，弃去上清，获得CIK细胞。
[0014] 下面通过对比实验来进一步说明本发明的效果： 一、单核细胞分离 将采血管用浸润酒精的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜。将60ml血样平均分装到 50ml离屯、管中，200化pm离屯、lOmin ;离屯、后吸至距分界面0. 5cm处为止，弃去底部剩余；用 生理盐水按1:1的比例稀释血细胞；加入到装有15ml淋己细胞分离液的50ml离屯、管中，添 加过程需缓慢，使其分界面呈清晰界