重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组病毒领域，具体涉及一种重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]人促红细胞生成素(hEPO)是一个分子量约为30KDa的糖蛋白，糖基化程度大约能达到分子量的40%左右。在胎儿发育过程中，hEPO主要是肝脏产生的，随着发育的进行，hEPO主要由肾脏产生，其主要的生理学作用是促进红系祖细胞向红细胞的生长与分化。由于基因重组技术的飞速发展，重组人促红细胞生素(rhEPO)已经可以通过包括C0S-1细胞、SF-9细胞和CHO细胞等各种表达系统规模化表达了，临床上主要使用rhEPO治疗肾性贫血症，近期也发现了 rhEPO具有保护神经、大脑和心脏等的非造血功能。与其它的蛋白类药物一样，rhEPO在临床上主要是通过静脉和皮下注射用于治疗肾性贫血症。然而，注射用药会引起患者的不适，并且也不方便，因此一种替代的用药途径是患者所迫切需要的，而口服给药由于安全方便而令人向往。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是目前尚无利用rhEPO的治疗肾性贫血症的口服药物。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明利用bac to bac系统构建rhEPO重组家蚕杆状病毒，并在家蚕蛹中高效表达，利用TF-1细胞对家蚕表达的rhEPO(重组蛋白BmrhEPO)进行体外生物学活性的检测。通过检测口服不同剂量的BmrhEPO后的肾性贫血小鼠血液中网织红细胞数及百分率来评估口服BmrhEPO的药效。
[0005]本发明提供的重组家蚕杆状病毒，该病毒是由重组转移载体pFastBac1-hEPO转化大肠杆菌，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO，然后，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEP0转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
[0006]作为优选技术方案，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕BmN细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
[0007]本发明提供上述的重组家蚕杆状病毒的制备方法，包括如下步骤:
1)制备人促红细胞生成素hEPO基因，将hEPO基因克隆到pFastBac I载体上，得到重组转移载体pFastBac1-hEPO ；
2)重组转移载体pFastBac1-hEPO转化大肠杆菌，经蓝白筛选后，得到含重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO的菌株,纯化后得到重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO ；
3)将重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
[0008]作为优选技术方案，步骤I)为合成hEPO cDNA基因，并将其克隆在PUC19载体上，设计以下引物:上游引物P1: 5 ’ -CGGAATTCATGGGGGTGCACGAAT-3 ’ ；下游引物P2:5 ’ -CCGCTCGAGTCATCTGTCCCCTGT-3 ’，分别弓 I 入酶切位点 EcoR I 和 Xho I，进行 PCR 扩增得到目的基因片段，PCR产物经过EcoR I和Xho I限制性内切酶切割后，使用高效连接酶克隆到pFast Bac I载体的相应的酶切位点上，得到重组转移载体pFastBac1-hEPO。
[0009]优选地，步骤2)所述大肠杆菌为DHlOBac E.coli ;步骤3)所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。
[0010]作为优选技术方案，步骤3)为将Bacmid-rhEPO转染处于对数生长期的BmN细胞，待细胞发病后，离心收集培养基上清液，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
[0011]本发明提供一种重组蛋白其由上述的重组家蚕杆状病毒接种家蚕中表达而得，该重组蛋白为SEQ ID N0.2所示序列。
[0012]本发明提供上述的重组蛋白作为制备治疗肾性贫血口服药物的用途。
[0013]本发明提供一种由上述重组家蚕杆状病毒制备的治疗肾性贫血口服的药物，所述药物的制备方法为:将所述重组家蚕杆状病毒接种家蚕蛹，蚕蛹发病后，以液氮研磨，冻干，制成蚕蛹冻干粉，即得。
[0014]本发明利用bac to bac系统构新了一种新的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO,并在家蚕蛹中高效表达重组蛋白BmrhEPO。
[0015]将vBmrhEPO接种家蚕蛹，发病后，将蚕蛹匀浆，制成蚕蛹冻干粉。
[0016]经ELISA检测，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO的含量达到8382IU/g。
[0017]利用BmrhEPO对TF-1细胞的生长、增殖的促进作用检测其体外生活学活性，结果显示，BmrhEPO具有与rhEPO(CH0细胞表达)相似的体外生物学活性。
[0018]小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验显示，口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147882IU/
kg ο
[0019]BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液进行小鼠口服BmrhEPO治疗肾性贫血的药效学实验显示，以 73958.8IU/kg、24652.9IU/kg、14791.8IU/kg 三个不同剂量连续口 服 BmrhEPO,小鼠血液网织红细胞数及百分率与阴性对照组相比均有明显升高，并且与口服剂量呈正相关，口服BmrhEPO治疗小鼠肾性贫血具有明显疗效。
[0020]本发明利用bac to bac系统构建的新的杆状病毒，耗时仅两周，比使用同源重组构建病毒的方法省时，不需要进行繁琐的病毒筛选，方法简单，操作性更强。现在rhEPO药物大都是注射液，价格昂贵，注射给药会给患者带来不适，而且不方便，而本发明生产的BmrhEPO蚕蛹粉直接用于口服，而且疗效明显，可减轻患者的不适，服用方便，而且成本较低，普通老百姓负担的起，将来开发成药物对于患者来说是福音。
【附图说明】
[0021]图1 为重组质粒 pFastBac 1-rhEPO 的鉴定，M:DNA Ladder Mix ；1:rhEP0 基因片段PCR扩增；2:重组质粒EcoR I和Xho I酶切。
[0022]图2为重组Bacmid-hEP0的PCR鉴定，M:marker 1:以Pl和P2为引物的PCR产物2:以Pl和M13 R为引物的PCR产物3:以P2和M13 F为引物的PCR产物4:以M13 F和R为引物的PCR产物。
[0023]图3为重组病毒vBmrhEPO PCR鉴定，M:DNA Ladder Mix ;1:以Pl和P2为引物的PCR产物。
[0024]图4为重组蛋白BmrhEPO在BmN细胞中表达的SDS-PAGE检测(a图)和WesternBlotting检测(b图),M:蛋白预染Marker ；1:接种重组病毒vBmrhEPO的BmN细胞的上清；
2:接种野生病毒BmNPV的BmN细胞的上清；3:rhEPO标准品(rhEPO注射液)。
[0025]图5为重组蛋白BmrhEPO在五龄蚕幼虫血淋巴中表达的SDS_PAGE(a图)和Western blotting(b图)鉴定，M:预染分子量标准蛋白；1:rhEPO标准品(rhEPO注射液);2:接种野生病毒BmNPV的五龄家蚕幼虫血淋巴上清的上清；3:接种重组病毒vBmrhEPO的五龄家蚕幼虫血淋巴的上清。
[0026]图6为重组蛋白BmrhEPO在蚕蛹中表达的SDS-PAGE检测(a图)和WesternBlotting检测(b图),M:蛋白预染Marker ；1:rhEP0标准品(rhEPO注射液);2:接种野生病毒BmNPV的蚕蛹上清；3:接种重组病毒vBmrhEPO的蚕蛹上清。
[0027]图7为重组蛋白BmrhEPO在蚕蛹中表达的ELISA检测标准曲线(R2=0.9995)。
[0028]图8为rhEPO作用于TF-1细胞的增殖曲线。
[0029]图9为模型组与空白对照组小鼠网织红细胞数。
[0030]图10为模型组与空白对照组小鼠网织红细胞百分率。
[0031]图11为模型组与空白对照组小鼠血肌酐浓度。
[0032]图12为模型组与空白对照组小鼠血尿素氮浓度。
[0033]图13为不同实验组小鼠网织红细胞数随时间的变化。
[0034]图14为不同实验组小鼠网织红细胞百分率随连续给药时间的变化图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0036]下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。
[0037]一、利用bac to bac系统构建重组病毒vBmrhEP