一种用于角蛋白酶解的复合酶解试剂及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白酶解技术领域，特别涉及一种用于角蛋白酶解的复合酶解试剂及应用方法。
【背景技术】
[0002]人类对天然角蛋白的加工利用已经有很长的历史了，其中最早的塑料制品就是以角蛋白为原料制成的。可生物降解塑料及生物医学材料越来越受到重视，其中研究的热点之一就是从毛发、禽羽毛等中提取角蛋白。羊毛角蛋白的加工和提取方法主要有两大类:机械法和化学法。机械法制备角蛋白一般是用加热(100-200°C)和加压(0.3-1.0Mpa)的方法破坏角蛋白内部的二硫键和肽链，使它变为可溶的、易消化的多肽混合物，多应用于饲料行业。化学法较为成熟的毛发水解方法，主要包括酸碱法、还原法、氧化法、铜氨溶液法、金属盐法、等。不同的水解方法，毛发角蛋白水解片段大小分布有所不同。以上方法主要存在以下问题:在毛发溶解过程中加入了大量的化学试剂，这些试剂的溶解效率不高，重复利用难度大，对环境造成一定的污染；另外，传统角质水解条件，温度在85°C以上，pH近12，这样的条件正是自由基和毒性物大量产生的根源，由此制得的角蛋白产品，往往含有较多的细菌和毒性物，若直接应用于食品，将存在较大的健康风险。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种酶解迅速、角蛋白降解率高且能有效抑制毒性物生成的一种用于角蛋白酶解的复合酶解试剂及应用方法。
[0004]实现上述发明目的的技术解决方案是:
一种用于角蛋白酶解的复合酶解试剂，包括链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶和还原剂。
[0005]作为优选，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦。
[0006]作为优选，所述的用于角蛋白酶解的复合酶解试剂包括:
链霉菌角蛋白酶(8万活性单位)I?2克/升；
酵母菌酶(纯含量98%) 1.5?2.5克/升；
三(2-羧乙基)膦的浓度为0.03?0.15克/升。
[0007]进一步优选，所述三(2-羧乙基)膦的浓度为0.06?0.09克/升。
[0008]作为优选，所述的用于角蛋白酶解的复合酶解试剂还添加有天然抗氧化剂。
[0009]作为优选，所述天然抗氧化剂为花青素，过氧化歧化酶/谷胱甘肽-S-乙醚/维生素A、C、E族的复配剂，翠雀素和表掊基儿茶酚掊酸中的一种或多种。
[0010]进一步优选，还添加有螯合剂乙二胺二琥珀酸酯。
[0011]一种用于角蛋白酶解的复合酶解试剂的应用方法，包括以下步骤:
1)先对含有角质蛋白的天然原料进行脱脂处理；
2)酶解:采用链霉菌角蛋白酶-酵母菌酶-还原剂三位一体复合酶解剂，调节复合酶解剂液PH值为4?5，随后将步骤I)经脱脂处理的含有角质蛋白的天然原料加入组合酶解剂液中，在室温并隔绝氧气条件下预处理15?25分钟，进一步调节组合酶解剂液PH值为7.0?7.5，控制温度为50?60°C，酶解12?24小时，得到角蛋白酶解液；
3)将角蛋白酶解液采用陶瓷微米孔微滤脱盐和/或用树脂脱色，得到角蛋白液；
4)将角蛋白液灭菌；
5)真空干燥，得角蛋白粉。
[0012]作为优选，所述步骤2)中还添加有天然抗氧化剂。
[0013]进一步优选，所述步骤2)中还添加有螯合剂乙二胺二琥珀酸酯。
[0014]本发明的有益效果为:
1、本发明所提供的复合酶试剂，即以链霉菌角蛋白酶、酵母菌酶和三(2-羧乙基)膦核心三元组合作角质蛋白的酶解试剂，具体分析如下:
I)链霉菌角质蛋白水解酶是一种复酶，是以二硫键还原酶打头阵，而胞外内切酶随后跟进的迄今对水解角蛋白相对效率最高的一种酶。
[0015]2)酵母在酶解过程中起到协合和消毒的作用:酵母可协同角质蛋白酶一起水解含碳、氮的肽链以协合增效；裂解亚细胞中的脂质，以防脂质过氧化生产毒素；能够以伯、仲、叔胺、二胺、多胺、三甲胺-N-氧化物，乙醇胺、胆碱、嘌呤、吡啶等碳和氮源，有效消除这些毒素；可将芳香胺、杂环氨基酸等带苦味物质消溶而脱苦味；酵母细胞会自溶，可作为经济的肽来源，增加终点蛋白产品，即蛋白粉含量增加，可用作婴儿和保健食品的营养补充成分。
[0016]传统的还原剂存在一些缺点:1)亚硫酸盐是迄今国内用得最普遍的，但恶臭味重，反应专一性差，副反应残留物有毒，如:CN92101599.2(公开日，1992年9月30日)，公开了一种水解角蛋白的方法，该发明所述方法使用含有亚硫酸根离子的水溶液处理固态角蛋白成分而得到变性的角蛋白，再用角蛋白酶水解生成角蛋白水解液，再处理后用作饲料添加剂和产生用于化妆品的寡聚肽；2)DE2705669(公开日为:1978年8月17日)、DE3305305 (公开日为:1983年8月25日)，均公开了连三硫酸和连四硫酸盐作为还原剂参与胱氨酸二硫键裂解生成半胱氨酸和S-硫代半胱氨酸，也叫亚硫酸盐解反应，然而，为消除硫化物的恶臭，必须添加铜离子，与pH9.0下处理再湿酸24小时，而后用大量水长时间冲清，显然无法大规模生成。3)谷胱甘肽做还原剂必须与谷胱甘肽酶和助剂一起使用，否则会出现氧化形态，甚至自由基形态，反而增加毒性的风险。本发明选择三(2-羧乙基)膦作为还原剂:水溶性好且无臭味；三(2_羧乙基)膦对角质蛋白的水解酶中最具活性的二个巯基:Cas-Cys-697和Cas-Cys_707位点上的作用远大于传统的还原剂DTT (其中Cas-表示羊绒粗纤维，Cys表示其中胱氨酸基)；三(2_羧乙基)膦的使用浓度为0.03?0.15克/升，它能更好地保留角质水解酶的活性，相对传统的DTT等会严重抑制角质蛋白酶中二硫键还原开裂蛋白酶的还原活性；近中性条件下(pH值为6.5?7.5)更为稳定；痕量的金属离子对三(2-羧乙基)膦不会产生有害物质；三(2_羧乙基)膦因磷-氧键和强度大，致使二硫键还原开裂变得不可逆转，因而大大提升了二硫键还原开裂效果，开裂速度快，还原效率高，在角质蛋白酶解过程中，还原剂能协助增效，所以酶解率进一步提高；另外，三(2-羧乙基)膦还原反应时受动力学而非热力学影响，故可在常温下快速反应。
[0017]2、通常在水解角蛋白粉的工艺过程中，存在着美拉德逐级反应，其特征是:①它是产生有毒有害物质的根源；②其有毒有害物质随逐级反应其种类和数量呈几何级数增长，因此需遏制毒素产生，如须从源头上着手，即在产生醛糖或酮糖或希夫碱(N取代糖基胺)时下手予以扼杀；传统角质水解条件，即85°C以上，pH近12的条件，正是自由基和毒性物大量产生的根源，本发明采用角质酶解工艺制备蛋白粉，在室温、近中性条件下(PH值为6.5?7.5)酶解，反应条件温和，可避免自由基和毒性物的产生，整个工艺绿色环保，所制得蛋白粉安全可靠。
[0018]进一步，绝大多数生毒的自由基形成与氧气有关，本发明用惰性气体氦在酶解角质蛋白的过程中隔绝空气中的氧气，抑制自由基的生成。
[0019]还有由于过氧化酶对过氧自由基不能脱毒，而谷胱甘肽在抗氧化过程中可能转化为氧化形态，甚至出现自由基形态，本发明打破传统用过氧化岐化酶/过氧化氢酶/谷胱甘肽三位一体的复配体系，优选出过氧化歧化酶/谷胱甘肽-S-乙醚/维生素A、C、E族的复配剂，以获协合增效，另外还添加了乙二胺二琥珀酸酯螯合剂，以有效抑制毒副产品四氢嘧啶衍生物之形成。