豆科植物根系组织特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种豆科植物组织中的特异性 启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 豆科植物具有重要的经济意义。其中，大豆是植物蛋白和食用油的主要来源，也是 世界上产量最多的油料作物。大豆是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白 质最丰富最廉价的来源。在今天世界上许多地方是人和动物的主要食物。对于我国而言， 豆科植物，尤其是大豆，更是一种重要的经济作物和粮食作物。
[0003] 常规育种方法在品质改良和新品种选育方面发挥着重要作用，但也存在育种年限 长、难以打破性状连锁、多基因重组几率低、远缘杂交困难等种种弊端。植物基因工程技术 能定向改良植物的不良性状，使植物获得常规方法难以得到的特定性状，并能大大缩短育 种年限，提高经济效益。此种技术在供体总DNA导入前不经过任何修饰和构建，从而避免基 因构建元件可能对生态和环境造成的负面影响。转基因育种技术可按人们的预选设计改良 作物，创造新种质，丰富种质资源，提高作物的品质、抗性、耐性、增加产量等，可极大的提高 育种效率，加快育种进程，对解决粮食和蔬菜安全、生态恶化、资源匮乏及效益低下等问题 具有重大的社会、生态和经济意义。
[0004] 转基因技术在我国主要农作物育种（水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、向日葵、油菜） 的应用已取得成果。特别是在大豆育种上，采用外源DNA导入技术将优良性状的目的基因 导入栽培大豆，获得的后代既保持了原有受体的产量，又培育出集高产、优质、优良性状于 一体的新品种和品系。例如，20世纪90年代，雷勃钧等人利用花粉管通道法将外源DNA导 入大豆，创造了优质高蛋白品系D89-982 (蛋白质占45. 32% )和双高品系D90 -1217 (蛋 白质+脂肪占66% )。黑龙江省农业科学院利用花粉管通道法进行遗传转化，即外源DNA 直接导入OIED)技术，将高蛋白野生大豆总DNA直接导入栽培大豆，育成了第一个大豆新 品种--黑生101。1996年，徐香玲、李兴华等利用具有质粒的发根农杆菌（大豆花叶病毒 外壳蛋白基因）感染大豆品种，得到转化植株，为大豆抗病育种提供了新的途径。徐香玲等 (1997)将PKT54B7C5上的B，t，K-8内毒蛋白基因通过农杆菌介导法导入大豆黑农37、黑农 39等品种，获得外源基因导入并整合到大豆基因组中的再生大豆植株。2001年，周思军、李 希臣等采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因（crylA)导入大豆。1999 年，徐香玲等利用农杆菌介导法，将抗真菌的几丁酶基因导入大豆品种--东农37号、吉林 28号等14个品种，得到转化植株。
[0005] 基因通过表达来体现其功能，而启动子是精确启动基因表达的"开关"。借助基因 工程的方法，利用组织特异性的启动子能够对植物进行针对性的育种改造。因此，组织特异 性启动子对于基因的表达调控研究具有重要意义。但是，出于种种原因，目前找到的组织特 异性启动子并不多。例如，有些基因，如非结构基因会发生基因移转，从而很难找到在特定 组织中特异性表达的相应启动子。对于启动子区域的普遍特征仅仅知晓启动子位于基因转 录起始位点的上游几kb的区域内，具有一定的保守序列特征，GC含量较高等等，技术人员 并不能仅仅根据这些普遍特征来精确定位启动子；事实上，即便设计多对PCR引物，也很有 可能无法精确定位启动子。此外，由于种种原因，许多基因确切的转录起始位点并未确定， 到目前为止，已阐明启动子序列以及它们的调控机制的基因数量非常有限。标准的真核生 物有关的启动子数据库Eukaryotic Promoter Database中登录的基因启动子也并不多。
[0006] 我国在转基因技术应用于农作物育种方面虽然已取得可喜成绩，但与国际水平相 比仍有较大的差距。寻找有效的组织特异性基因，并构建高效可用的转化载体是改良大豆 品质性状和研究大豆功能基因的先决条件。但是转基因质粒的构建是该技术的瓶颈之一， 其主要原因是缺乏有效的转基因载体能定向在豆科植物中进行组成型表达，或进行组织特 异型表达；以及缺乏能高效转化的载体。
[0007] 综上所述，本领域急需找到豆科植物，特别是大豆中的组织特异性启动子，进而准 确有效地改变豆科植物的各种性状，改良其品系，更好地调控其生长发育以及产量。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种豆科植物的组织特异性启动子及其应用。
[0009] 在第一方面，本发明提供一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：
[0010] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不的多核苷酸；
[0011] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(较佳地彡98%)，且具有 豆科植物根系组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；
[0012] (c)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或增加1-60个（较佳 地1-30,更佳地1-6个）核苷酸，且具有豆科植物根系组织中特异启动功能的启动子活性的 多核苷酸。
[0013] 在优选的实施方式中，所述的豆科植物根系组织中特异启动功能表示，所述启动 子在豆科植物的根系组织以外的组织中不具有启动功能。
[0014]在优选的实施方式中，所述的豆科植物包括百脉根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜猜（Medicago sativa) 〇
[0015] 在另一优选的实施方式中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 在第二方面，本发明提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因 可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件。
[0017] 在优选的实施方式中，所述的外源基因在天然状态下并不存在。
[0018] 在另一优选的实施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋 白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0019] 在另一优选的实施方式中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基 因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。
[0020] 在另一优选的实施方式中，所述的筛选标记基因选自下组：gus(0-葡萄糖苷酸 酶）基因、hyg(潮霉素）基因、neo (新霉素）基因、或gfp (绿色荧光蛋白）基因。
[0021] 在另一优选的实施方式中，所述的抗原蛋白基因选自下组：细菌类抗原蛋白（如 霍乱毒素B，破伤风毒素等）、病毒类抗原蛋白（如犬细小病毒）、原生动物类抗原蛋白（如 阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白（如I型糖尿病的CTB - pins抗原蛋白）。
[0022] 在另一优选的实施方式中，所述的生物制剂基因选自下组：a 2b干扰素基因、或 胰岛素样生长因子基因。
[0023] 在另一优选的实施方式中，所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关 基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因、或雄性不育相关基因。
[0024] 在第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒从5'至3'依次具有下述元件： 权利要求1所述的启动子元件、基因0RF序列和终止子。
[0025] 在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly (A) 元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。
[0026] 在第四方面，本发明提供一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子 元件、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0027] 在优选的实施方式中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病 毒载体、穿梭载体。
[0028] 在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述 的载体、或其染色体上整合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体上整 合有本发明第三方面所述的表达盒。
[0029] 在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个（如1-50个，较佳 地2-6个）拷贝的权利要求1所述的启动子元件、或权利要求3所述的表达盒。
[0030] 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞（如大肠杆菌、链 霉菌属、或农杆菌）、低等真核细胞（如酵母细胞）、或高等真核细胞（如植物细胞）。
[0031] 在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，更佳地为农作物、蔬菜、 或花舟的植物细胞，更佳地为豆科植物细胞，最佳地为百脉根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜猜（Medicago sativa)植物细胞。
[0032] 在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的启动子元件，本发明第二方面所 述的构建物，本发明第三方面所述的表达盒用于特异性调控外源基因在豆科植物根系组织 中的表达的用途。
[0033] 在第七方面，本发明提供一种在豆科植物根系组织中特异性表达外源基因的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0034] (a)提供一构建物