基因重组沙门氏菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种包含s499_789基因重组沙门氏菌。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻疾病（Porcine epidemic diarrhea，PED)的病 原，该病以产房1-7日龄仔猪淡黄色水样腹泻、严重脱水为主，剖检可见仔猪肠道内胀气、 有黄色乳凝块。PEDV主要通过粪-口途径传播，产房仔猪通过消化道摄入病毒后，病毒主要 入侵空肠和回肠部位小肠黏膜上皮细胞，并开始病毒复制。PEDV的感染导致上皮细胞膜表 面的双糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶）、氨肽酶、碱性磷酸酶的活性下降；同时，肠绒毛上 皮细胞正常结构破坏并发生细胞破碎，造成肠绒毛萎缩，肠道表面积减少，从而导致小肠消 化不良、吸收不良等机能障碍，诱发仔猪发生腹泻并脱水。
[0003] PEDV最早在英国发现，并流行于欧洲从上世纪八十年代以后，中国、日本、韩国也 开始有所报导。2010年至今，该病已广泛流行于中国、韩国、泰国、美国等国。该病对产房仔 猪极高的发病率和致死率、较高的治疗成本及防控成本，以及病毒基因发生变异造成强毒 株的出现，对世界养猪业造成了巨大的损失。
[0004] 随着PEDV分子生物学研宄的深入，PEDV免疫机理基本清楚，属于典型的局部黏膜 免疫为主，存在于血清中PEDV IgG不能提供有效保护，而肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗 体（SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔猪通过初乳来获得母源SIgA，从而产生对流行性腹泻的被 动免疫保护。
[0005] 目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返强及散毒的风险，需要 改进。为了研制出更为安全、高效、成本低廉、保存和使用方法简易的猪流行性腹泻疫苗，人 们开始利用基因工程手段开发黏膜免疫疫苗，以期达到进一步预防和控制该病的目的。如， 徐丽丽等构建了可表达PEDV S蛋白C0E区域、SD区域的减毒沙门氏菌重组疫苗，其包含的 抗原基因长，菌株稳定性越差，同时其包含crp毒力基因，安全性难以保证。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的重组菌株。
[0007] 本发明提供了一种如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明重组载体，包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体 是重组pVAXl。
[0009] 本发明重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
[0010] 所述的重组菌为重组沙门氏菌或者重组大肠杆菌。
[0011] 所述的重组沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。
[0012] 本发明还提供了一种重组蛋白，它是由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列编码。它 的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0013] 目的基因S499_789核苷酸序列（SEQ ID NO :1):
[0014] Gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt attcccacca actttagtat gagtatt
[0015]对应的S499_789氨基酸序列（SEQ ID NO :2):
[0016] VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVENANVNLVVVDEDVTLNTTGRTVVVDGLAFFE SDGFYRHLADADWIEHPVYKSACELKPVroCDPIPDFPLPVAASVAELCVQTDLLLKNYNTPYKTYSCWRGDKCC ITCTLQFKAPSYVEDAVNFVDLCTKNIGTAGFHEFYITAHEQQDLQGFLTTCCTMSGFECFMPTIPQCPAVLEEIDG GSIWRSFITGLNTMWDFCKRLKVSFGLDGIVVTVARKFKRLGALLAEMYNTYLSTVVENLVLAGVSFK
[0017] 在研宄过程中，发明人根据经验选择S蛋白的第499-789段基因片段，制备得到了 免疫原性非常强的重组菌株，其产生的针对猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体高于灭活 疫苗，可以有效预防猪流行性腹泻疾病，取得了意料不到的技术效果。
[0018] 本发明包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重组沙门氏菌免疫猪后，可以产生大 量针对猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体，用其制备的疫苗对猪流行性腹泻病毒为猪流 行性腹泻疾病有良好的保护作用，且SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列短，制备的重组菌株稳定 性好，不包含crp毒力基因，安全性好，临床应用前景优良。
[0019] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0020]图1 S499_789基因扩增。M :DNA Marker III ;1，2S 499_789基因扩增；
[0021]图2 pMD19-T-S499_789的鉴定。M :DNA Marker III ;1:S 499_789基因扩增； 2:pMD19-T-S499_789双酶切鉴定；
[0022]图3 pVAX-S499_789的鉴定。M :D