0)菌液按1%的量接入100 mL含有 50 Pg/mL Kan+的LB液体培养基中，37 °C、220 rpm培养2.5 h左右至0D 600为0.6， 向培养基中加入终浓度为0.1 mM的IPTG，相同条件下诱导培养4h。诱导后的菌液，在4 °C、8000 rpm下离心15min，倒弃上清液，用PBS buffer洗漆细胞沉淀，再次离心，向总的细 胞沉淀中加入6 mL预冷的细胞裂解液，充分悬浮菌体。冰浴条件下超声间歇破碎菌体细 胞，超声条件为：超声功率200 W，破碎10 s，间歇10 s，总时间20 min。破碎后的液体4 °C、8000 rpm离心20 min,收集上清液，沉淀用PBS Buffer洗漆两次，用与之前上清相同 体积的PBS buffer悬浮沉淀。分别取25 ML的上清和沉淀与2XSDS-PAGE上样缓冲液 等体积混合，在沸水浴中处理10 min。冷却离心后取10 ML进行SDS-PAGE。以相同条件 下IPTG诱导的BL21 (pET-28a)菌体为对照实验组。
[0047] 图2为SDS-PAGE检测蛋白的表达结果。其中，泳道1 :BL21 (pET-28a)全菌 蛋白；泳道2:BL21(pET-28a-Tm350)全菌蛋白；泳道3:纯化表达重组蛋白；泳道4: BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎上清；泳道4 :BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎包涵体沉淀。 说明该融合蛋白为包涵体形式存在。
[0048] (3)Ni_NTA亲和层析纯化重组蛋白 A.将上述离心的包涵体沉淀蛋白用LE buffer重新悬浮，在37°C水浴lh以至溶液澄 清，溶解后的液体4 °C、12000 rpm离心20 min，收集上清液。
[0049] B.取5 mL的Ni2+树脂装入柱子中，柱子规格为1.6X20cm，柱床体积为5 mL， 待自然沉降后，用3倍柱体积的LE buffer平衡。
[0050] C.将收集的上清液加入平衡后的Ni-NTA柱子中，流速为0.5 mL/min，收集滤出 液。
[0051] D.待柱子中的上样液全部流尽后，向柱子中加入5倍柱体积的LE buffer，流速 为2mL/min，收集滤出液。
[0052] E.待柱子中液体流尽后，分别用含 10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM 咪唑的缓冲液依次加入柱子中，每种缓冲液为2倍柱体积，流速为1 mL/min，分别回收各种 缓冲液的滤出液。
[0053] F.用3倍柱体积的LE buffer清洗柱子，然后用3倍柱体积双蒸水再次清洗，最 后用3倍柱体积的20%乙醇洗柱子，流速均为2 mL/min，最终使树脂浸没在20%乙醇中，置 于4 °C保存。
[0054] G.对以上收集的液体进行SDS-PAGE检测。
[0055] 图3为SDS-PAGE检测NI-NAT亲和层析纯化蛋白图。泳道1-9分别为： BL21(pET-28a)全菌蛋白；包涵体蛋白上样液；过柱流出液；LEbuffer洗涤液；10 mM咪 唑洗脱液；20 mM咪唑洗脱液；50 mM咪唑洗脱液；100 mM咪唑洗脱液；200 mM咪唑洗脱 液。结果说明杂蛋白在10 mM咪唑洗脱液中完全洗去，融合蛋白于介质结合能力较强，在 100 mM咪唑洗脱液中大量洗出。
[0056] 实施例3:重组蛋白的复性 将透析膜剪成适当长度（15 cm)的小段，注意戴手套，不能直接碰触透析膜；然后将透 析膜放入2% (w/v) NaHCOjP ImM EDTA(pH8.0)中沸煮lOmin，用蒸馏水彻底清洗透析膜， 然后放入ImM EDTA(pH8. 0)中煮沸lOmin ;用蒸馏水清洗后，将上述纯化回收的重组蛋白液 体放入透析膜中，用夹子夹住；再将透析膜依次放入不同的透析缓冲液中，每次在4°C冰箱 放置6h，其尿素浓度分别8M，4M，2M，1M，0. 5M，0. 25M，0M，最后在生理盐水/蒸馏水中4°C 透析6h ;将透析好的蛋白分装，-70°C保存。透析膜用蒸馏水清洗干净，浸泡在50%甘油中， 4 °C冰箱放置保存。
[0057] 实施例4:脂肪酶活性的检测 脂肪酶酶活力是通过分光光度法去检测以p-nitrophenyl butyrate作为底物在 405nm处的吸光值大小来测定的。以10 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.5)为对照，酶活测定 体系包括：在10 mol/L的PBS缓冲液（pH 7. 5)加入终浓度为7. 5l^g/mL脂肪酶酶液，70 °C水浴锅保温10 min后，再加入终浓度为2 mmol/L作用底物对硝基苯丁酸酯（p-NPB)， 在70°C反应2 min后，迅速在紫外可见分光光度计下检测405 nm的吸光值；该数值减去 以PBS缓冲液和2 mmol/L p-NPB为对照组的反应值即为脂肪酶酶活的变化。以1 min内 催化产生1 U mol对硝基酚所需的酶量为1个酶活力单位（U)，其中对硝基酚的消光系数 e =165400 L/(mol X cm)。计 算公式如下：
【主权项】
1. 一种原核表达载体pET-28a-Tml350,其特征在于，所述载体包含来源于极端嗜热菌 海栖热袍菌脂肪酶Tml350基因，其中脂肪酶Tml350基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列。
2. -种原核表达的宿主细胞凡coB BL 21 (pET-28a-Tml350)，其特征在于，所述宿主 细胞包含有权利要求1所述的原核表达载体pET-28a-Tml350。
3. -种脂肪酶Tml350基因在制备重组脂肪酶中的应用。
4. 根据权利要求3所述的一种脂肪酶Tml350基因在制备重组脂肪酶中的应用，其特征 在于，所述应用为所述脂肪酶Tml350基因通过原核表达诱导重组脂肪酶的表达，具体操作 步骤如下： 构建含有脂肪酶Tml350基因核苷酸序列的原核表达载体pET-28a-Tml350 ; 获得含有原核表达载体pET-28a-Tml350的宿主细胞凡coB BL 21 (pET-28a-Tml350)； 诱导表达获得重组脂肪酶。
5. -种脂肪酶Tml350的固定化方法，其特征在于，按照以下步骤进行： (1) 构建一个以CotB为锚定蛋白的高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体 pHS-CotB ； (2) 将脂肪酶Tml350基因与步骤（1)中的穿梭表达载体相连，得到重组表达载体 pHS-cotB-Tml350 ； (3) 将重组表达载体pHS-cotB-Tml350转入宿主菌株枯草芽孢杆菌DB403中，得到孢子 表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌。
6. -种权利要求5获得的穿梭表达载体pHS-CotB。
7. 根据权利要求6所述的一种权利要求5获得的穿梭表达载体pHS-CotB，其特征在 于，所述载体含有大肠杆菌复制起点，氯霉素抗性基因，枯草芽孢杆菌复制、转录起始位点 以及CotB基因的调控表达序列和结构蛋白序列。
8. -种权利要求5获得的重组表达载体pHS-cotB-Tml350,其特征在于，所述重组表达 载体包含脂肪酶Tml350基因序列和权利要求7所述的穿梭表达载体pHS-CotB。
9. 一种孢子表面展示脂肪酶Tml350基因的重组枯草芽孢杆菌DB403 (pHS-c 〇tB-Tml350)，其中在于，所述重组枯草芽孢杆菌包含权利要求9所述的重组表达载 体 pHS-cotB_Tml350。
10. -种表面展示脂肪酶Tml350基因的重组芽孢，其特征在于，该重组芽孢是枯草芽 孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，芽孢表面展示有脂肪酶Tml350基因。
【专利摘要】本发明涉及一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法，属于酶工程及分子生物学应用领域；该脂肪酶Tm1350基因来源于极端嗜热菌，本发明将该基因构建到原核表达载体pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-Tm1350，转入宿主细胞E.coli BL 21，诱导重组脂肪酶的表达，然后纯化并鉴定其酶学性质；通过构建高拷贝数的穿梭表达载体pHS-CotB-Tm1350，转入枯草芽孢杆菌菌株DB403中，诱导重组孢子产生，随衣壳蛋白CotB的组装，该酶共表达在孢子表面。本发明首次通过孢子表面技术对脂肪酶固定化，该脂肪酶具有很好的热稳定性，耐碱性，甲醇激活性及耐甲醇性，具有很大的工业化应用潜能，如生物柴油的制备；该酶展示在孢子表面，不仅稳定性更好，而且通过简单离心或过滤就可回收利用，具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12N11-16, C12N15-70, C12R1-125, C12N15-75, C12N1-21, C12R1-19, C12N9-20
【公开号】CN104673817
【申请号】CN201510077614
【发明人】陈华友, 田瑞, 张天喜, 倪忠, 张清, 孙腾云, 陈志 , 陈克平, 杨胜利
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日