的生产工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺，通过添加表面活性剂改变细胞膜通透性，解除胞内产物的反馈抑制，有效提高黄杆菌产维生素K2发酵能力。
【背景技术】
[0002]维生素K又称抗出血维生素，是具有叶绿醌生物活性的α -甲基-1，4-萘醌衍生物的总称，体内包括维生素&和维生素K 2。维生素Κ2(简写为ΜΚ-η)为系列化合物，统称为甲基萘醌类，其侧链有一不饱和的多异戊二烯基，根据侧链长短的不同有多种形式，最常见的是侧链上有4?10个类异戊二烯基的甲基萘醌(从ΜΚ-4到ΜΚ-10)。维生素K2具有多种生理功能，如维生素K2可促进凝血酶原的形成，维持机体的正常凝血，可以通过促进谷氨酸残基羧化成γ -羧化谷氨酸残基促进骨骼形成，还具有利尿、强化肝脏的解毒功能，预防肝硬化发展为肝癌等多种生理功能。神经科学家Patrik Verstreken研宄小组发现维生素K2能恢复导致帕金森氏症的一个遗传缺陷的影响，为帕金森氏患者带来新希望。帕金森疾病中pinkl基因突变会影响线粒体功能，果幡中的UBIADl/Heix是pinkl的调节基因，维生素K2能恢复Heix突变引起的严重线粒体缺陷。表明维生素K 2在医药工业上有进一步的应用潜力。
[0003]黄杆菌属革兰氏阴性菌，能够发酵生产维生素K2，主要合成ΜΚ-4和ΜΚ-6，其维生素1(2的合成主要发生在胞内，而胞内发酵产物的合成量往往受到不断累积的产物的反馈抑制，如果在不影响菌体生长的基础上，能使胞内发酵产物不断溢出到胞外可避免反馈抑制，控制代谢流流向目标产物，对于提高黄杆菌胞内胞外维生素K2的总产量具有重要意义。
[0004]表面活性剂由于其独特的结构特征，具有增加细菌细胞膜通透性的作用，可使代谢产物分泌到细胞外，消除代谢产物的负反馈作用，使产物在发酵液中积累，最终达到了提高产率的目的。目前，表面活性剂作为发酵促进剂主要致力于诱发谷氨酸分泌的机理方面的研宄。渗漏模型(leak model)是普遍接受的机制。1968年，Takinami等根据生物素和脂肪酸与谷氨酸积累的相互关系的研宄结果认为，生物素的缺乏降低了脂肪酸合成酶活性，引起磷脂含量的减少并改变磷脂和脂肪酸的组成，导致磷脂双分子层物理性质的改变，对谷氨酸具有可透性，引起谷氨酸被动扩散的溢出降低了胞内浓度，使胞内谷氨酸浓度控制在某一规定水平下而解除谷氨酸的反馈抑制，于是菌体细胞继续合成谷氨酸并分泌出去。Huchenq等发现表面活性剂抑制了细胞膜脂肪酸的合成，从而改变了细胞膜的组成成分，改变其通透性，使产生的谷氨酸能更好的渗透到细胞外。Duperray等通过加入两种季钱盐表面活性剂(DA、DTA)，研宄谷氨酸分泌到细胞外的诱发机制，结果表明季铵盐类表面活性剂可以有效提高谷氨酸的分泌量。非离子表面活性剂毒性较小，几乎不影响菌体的生长，在保证生物量不变的前提下，非离子表面活性剂对促进营养物质的传递吸收，提高维生素1(2的产量具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺，包括如下步骤:
[0007](I)、一级培养:取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养12_24h，该一级种子培养基的组成为:麦芽糖20-30g/L、牛肉膏10-20g/、L、K2HP044_5g/L、NaCl3-4g/L、MgSO4.7H20 0.3-0.5g/L，且该一级种子培养基的 pH 为 7.0 ;
[0008](2)、二级培养:取步骤(I)的一级种子瓶培养液，按3-8%接种量接种于二级种子培养基中培养24-36h，该二级种子培养基的组成为:麦芽糖10-20g/L、酵母浸膏5_15g/L、K2HP042-4g/L、NaCl 2_3g/L、MgSO4.7H20 0.2-0.4g/L、且该二级种子培养基的 pH 为 7.0 ;
[0009](3)、发酵培养:取步骤⑵中的二级种子瓶培养液，按5-10%接种量接种于500ml摇瓶或3.7L-30L发酵罐中，培养8_48h后，添加0.005-5 %表面活性剂继续发酵培养120-200h ；
[0010](4)、胞内提取:将步骤(3)得到的发酵液离心弃上清，菌体真空冷冻干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色谱法分析测定；
[0011](5)、胞外产物提取:将步骤(3)得到的发酵液以15000r/min离心旋转lOmin，取上清，加入同等体积的正丁醇，漩祸震荡lOmin，混勾后再以10000r/min离心旋转5min，取上层有机相采用高效液相色谱法分析测定。
[0012]作为上述方案的进一步优化，步骤(3)中加入的表面活性剂选自阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂中的一种或几种。
[0013]作为上述方案的进一步优化，所述阳离子型表面活性剂选自脱氢枞胺(DA)、十二烷基三甲基溴化铵(DTA)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或三乙醇胺(TEA)。
[0014]作为上述方案的进一步优化，所述阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、月桂醇硫酸钠、十二烷基苯磺或十二烷基硫酸铵。
[0015]作为上述方案的进一步优化，所述非离子型表面活性剂选自Tween-60、Tween-80、APG,TtitonX-100 或 OP-1O0
[0016]作为上述方案的进一步优化，所述两性离子型表面活性剂选自烷基二甲基甜菜碱、烷基二甲基磺乙基甜菜碱、烷基二甲基羟丙基磷酸脂甜菜碱或十二烷基氨基丙酸。
[0017]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明的一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺通过添加不同种类、浓度的表面活性剂，一方面提高黄杆菌细胞膜的通透性，促进胞内代谢产物的释放，解除胞内代谢物对其自身合成的反馈抑制，提高维生素K2的产量；另一方面有利于产物的分离纯化和连续生产，提高生产效率，降低成本，为维生素K2的大规模工业化生产提供参考。
【附图说明】
[0018]图1为本发明一种基于黄杆菌产维生素1(2的生产工艺的实施例一的胞内维生素K2产量的HPLC检测图。
[0019]图2为本发明一种基于黄杆菌产维生素1(2的生产工艺的实施例一的胞外维生素K2产量的HPLC检测图。
[0020]图3为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例二胞内维生素K 2产量的HPLC检测图。
[0021]图4为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例二胞外维生素K 2产量的HPLC检测图。
[0022]图5为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例三胞内维生素K 2产量的HPLC检测图。
[0023]图6为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例三胞外维生素K2产量的HPLC检测图。
[0024]图7为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例四胞内维生素K2产量的HPLC检测图。
[0025]图8为本发明一种基于黄杆菌产维生素K2的生产工艺的实施例四胞外维生素K 2产量的HPLC检测图。
【具体实施方式】
[0026]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0027]实施例一
[0028]本实施例以黄杆菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作为出发菌株，包括以下步骤:
[0029](I)、一级培养:取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养12h，该一级种子培养基的组成为:麦芽糖20g/L、牛肉膏10g/L、K2HP044g/L，NaCl 3g/L、MgSO4.7H200.3g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0 ;
[0030](2)、二级培养:取步骤⑴的一级种子培养液，按3%接种量接种于二级种子培养基中培养24h，该二级种子培养基的组成为:麦芽糖10g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H20 0.2g/L、且该二级种子培养基的pH为7.0 ;
[0031](3)、发酵培养:取步骤⑵中的二级种子瓶培养液，按5%接种量接种于500ml摇瓶，发酵培养20h后，添加Tri tonX-100为0.05%，继续发酵培养36h后，加入十二烷基硫酸钠为0.1 %，继续发酵培养120h提取发酵产物；
[0032](4)、胞内产物提取:将步骤(3)得到的发酵液离心弃上清，菌体真空冷冻干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色谱法分析测定；参见图1，为本实施例的胞内维生素K2产量的HPLC检测图。
[0033](5)、胞外产物提取:将步骤(3)得到的发酵液以15000r/min离心旋转lOmin，取上清，加入同等体积的正丁醇，漩祸震荡lOmin，混勾后再以10000r/min离心旋转5min，取上层有机相采用高效液相色谱法分析测定，参见图2，为本实施例的胞外维生素K2产量的HPLC检测图。
[0034]通过本实施例的工艺步骤制备的维生素K2总产量提高了 150%。
[0035]实施例二
[0036]本实施例以黄杆菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作为出发菌株，包括以下步骤:
[0037](I)、一级培养:取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养18h，该一级种子培养基的组成为:麦芽糖25g/L、牛肉膏10g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0 ;
[0038](2)、二级培养:取步骤⑴的一级种子培养液，按5%接种量接种于二级种子培养基中培养24h，该二级种子培养基的组成为:麦芽糖20g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H200.4g/L、且该二级种子培养基的pH为7.0 ;
[0039](3)、发酵培养:取步骤⑵中的二级种子瓶培养液，按10%接种量接种于500ml摇瓶，发酵培养1h后，添加0P-10为0.005%，发酵30h后，加入CTAB为2%，继续发酵培养180h提取发酵产物；
[0040](4)、胞内产物提取:将步骤(3)得到的发酵液离心弃上清，菌体真空冷冻干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色谱法分析测定；参见图3，为本实施例的胞内维生素K2产量的HPLC检测图。
[0041](5)、胞外产物提取:将步骤(3)得到的发酵液以15000r/min离心旋转lOmin，取上清，加入同等体积的正丁醇，漩祸震荡lOmin，混勾后再以10000r/min离心旋转5min，取上层有机相采用高效液相色谱法分析测定，参见图4，为本实施例的胞外维生素K2产量的HPLC检测图。
[0042]与传统工艺相比，通过本实施例的工艺步骤制备的维生素K2总产量提高了 200%。
[0043]实施例三
[0044]本实施例以黄杆菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作为出发菌株，包括以下步骤:
[0045](I)、一级培养:取黄杆菌试管斜面一环，接种于一级种子培养基中培养24h，该一级种子培养基的组成为:麦芽糖30g/L、牛肉膏10g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且该一级种子培养基的pH为7.0 ;
[0046](2)、二级培养:取步骤(I)的一级