利用全基因组和est数据开发多态性est-ssr标记的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用全基因组和EST数据开发多态性EST-SSR标记的方法，属于分子 生物学领域。
【背景技术】
[0002] SSR标记的原理是与微卫星序列相邻的两侧区域保守性通常较高，可以在此保守 区域设计一对特异的PCR引物，扩增其中的微卫星序列，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显 示出个体间在此位点的微卫星序列的多态性。由于SSR在基因组中大量地、随机地分布，具 有广泛的位点变异，揭示比RAPD、RFLP更多的多态性，并且SSR标记为共显性标记，能够区 分纯合型和杂合型，提供完整的遗传信息，在检测多态性时可以采用PCR方法，不需要过多 的分子克隆手段，对DNA模板的要求不高，重复性好。因此成为日前运用最广泛的分子标记 之一，广泛地运用于动植物、微生物鉴定、遗传多样性分析、分子标记连锁图的构建和群体 遗传学等遗传与育种研宄领域。
[0003] 传统的SSR标记是通过构建小片段或大片段的基因组，筛选阳性克隆。通过传统 的影印或挑单菌落点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序列重复 寡核苷酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆，然后 测序、设计引物、优化PCR反应条件，获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后 测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，获得稳定、可靠的SSR标记，耗 时耗力，而且成本非常高。
[0004] 随着测序技术的不断发展，基因组序列数据资源不断增加，人们开始利用生物信 息学方法基于基因组序列数据筛选SSR位点，采用遗传差异足够大的多个基因组序列或生 物样本对候选SSR标记进行多态性筛选和鉴定。基因组序列或生物样本间遗传差异小会导 致具有潜在利用价值的多态性SSR标记被误淘汰；仅采用基因组序列数据开发的多态性分 子标记通常位于基因间序列，通常只适合于遗传多样性及其相关研宄，在与基因（遗传功 能）有关的研宄（如功能基因克隆）中应用价值有限。
[0005] 现在开发SSR标记的序列的另一种来源是EST，由于基因功能组学的快速发展， EST被大量测序，并存放在公共序列数据库中，利用EST序列，筛选开发SSR标记的方法简 单易行，已发展成为开发SSR标记的主要方法。但是建库时，数据库中的EST是由不同的研 宄者用随机或鸟枪法获得的，这就会造成EST的冗余性。在进行EST-SSR标记开发时，SSR 位点搜索前要先对EST数据进行比对、拼接，去除冗余序列否则极有可能对同一个SSR位点 设计不同的引物，并且费时费力存在错误拼接的可能，而且去除的冗余序列中可能含有SSR 长度的多态性。综合现在所有的SSR标记方法，新开发的标记通常都需要采用两个以上不 同基因组序列对候选SSR标记进行多态性筛选和鉴定，否则就需要运用基因型差异足够大 的多个样本DNA进行实验室筛选和验证，其间供试基因组序列、样本间无差异的SSR标记必 然会被淘汰。而对于基因组序列数据来源较少、差异小和供试基因型样本的差异不大、代表 性不足、具有潜在利用价值的多态性SSR标记极有可能被误淘汰。因此，现有技术还有待于 改进和发展。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明目的在于：提供利用全基因组和EST数据开发多态性EST-SSR标 记的方法，该方法可以大大提高全基因组数据来源较少、实验室验证时供试样本间差异较 小，但EST数据较丰富的物种EST-SSR标记的开发效率，并防止因供试验证基因组序列或实 验材料遗传差异不足而淘汰具有潜在利用价值的SSR标记。所开发的多态性EST-SSR标记 与单一基因紧密关联，具有更高的遗传与育种应有价值。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：
[0008] 利用全基因组和EST数据开发多态性EST-SSR标记的方法，包括下述步骤：
[0009] 一种利用全基因组和EST数据开发多态性EST-SSR标记的方法，其特征在于，包括 下述步骤：
[0010] ①获取基因组序列与EST数据，从公共数据库下载基因组序列数据、相应的基因 注释信息和EST数据，用基因组注释信息进行基因组外显子、内含子序列分析，选取基因 TSS转录起始位点前2000bp作为启动子序列；
[0011] ②将步骤①获得的全基因组数据进行SSR位点搜索与分析，采用MISA程序扫描全 基因组染色体DNA序列，搜索、分析基因组序列中包含的SSR位点。采用MISA程序的默认 SSR扫描参数：单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复 以及六核苷酸重复，重复单元分别大于1〇、7、6、5、4、4次重复；距离100bp的视为一个SSR 位点；每种重复基元的各种变异类型及其反向互补类型均归为一类；
[0012] ③单一 SSR位点筛选，采用Perl编写程序，从每个SSR结构域前若干碱基对（如 5bp)开始，提取18~24bp的序列作为电子模拟PCR扩增的上引物；间隔10~24bp后，提 取18~24bp序列，反向重复后作为下引物；采用Bowtie软件将引物序列比对到步骤①所 下载的参考基因组上，根据需要允许若干（如1~3)个碱基的错配；采用Perl语言编写程 序，鉴定、筛选单一 SSR位点；
[0013] ④EST中多态性SSR位点鉴定与分析，采用序列比对软件Bowtie以EST序列为模 板，以具有单一侧翼序列的SSR比对引物进行比对，采用Perl语言编程统计匹配区域长度 信息；
[0014] ⑤多态性EST-SSR位点筛选，筛选EST模板中有2个以上模拟扩增产物，且产物具 有多态性（长度差异）的EST-SSR位点；
[0015] ⑥多态性EST-SSR标记引物设计，采用引物设计软件设计多态性EST-SSR标记引 物。
[0016] 上述方法中所述基因组和EST数据可以是植物基因组和EST数据；也可以是动物 基因组和EST数据；也可以是微生物基因组和EST数据。在获得一定数量的EST数据的基 础上，该方法适用于所有物种，更特别地适用于基因组序列数据来源较少、差异小和供试基 因型样本的差异不大、代表性不足的物种，具体如马铃薯。
[0017] 本发明所提供的利用全基因组和EST数据开发多态性EST-SSR标记的方法，由于 采用了首先在全基因组序列中进行SSR位点搜索、筛选，筛选到基因