一种用于检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于检测[基因127bp deletion可变 剪接体的引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 瘦素（Leptin)主要是由非鸟类脊椎动物白色脂肪组织分泌的小肽类激素，与瘦 素受体（LEPR)结合发挥其生物学功能。然而，LEPR的功能研究由于禽内源性L印tin的缺 乏而受到限制。最近，鸟类乂印以/?基因的成功克隆将鸟类L印tin及LEPR的研究又推向了 新的高潮。鸟类(基因组织广泛性表达特征已得到证明，但其多种可变剪接体的鉴别和 分离进展相对缓慢，这将在一定程度上阻碍了 ZiFTt基因生理功能的研究。因此利用分子生 物手段鉴别某一剪接体组织表达模式，进而对其生物学功能的阐明具有推动作用，意义重 大。
[0003] 可变剪接体是影响蛋白质发挥功能的重要原因之一。LEPR是一种跨膜受体，属 于I类细胞因子受体家族，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。目前的研究将LEPR 的可变剪接体分为3类，即：长型、短型和可溶型。在小鼠中已经发现6种LEPR剪接异构 体（LEPR-a，b，c，d，e，f)，其中包括长型（LEPR-b)、短型（LEPR-a，c，d，f)和可溶型 (LEPR-e)，其功能研究近年来也取得了一定的进展。然而，在鸟类尤其是禽类中仅发现两种 LEPR剪接异构体(长型和短型)，而且检测繁琐、耗时长、准确率低，因此深入探究剪接体的 生物功能是亟需解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，为客服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种检测基 因127bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，可有效解决现 有的检测方法程序繁琐、耗时长、准确率低的问题。
[0005] 本发明解决的技术方案：在对鸟类(如鹌鹑）的基因克隆和功能研究的过程 中发现在第9外显子和第10外显子之间有一 127bp的缺失片段，这种缺失符合GT-AG剪接 模式，预测蛋白序列属于可溶型受体，据此本发明解决的技术方案是 一种用于检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的引物，包括引物对P和引物对 ACTB, 所述的引物对P为： 上游引物，P_F:5' - CTTGTGAACGATCGCATGTG -3' ； 下游引物，P-R:5' - GTGGTATCTTAACTGCAAGG -3' ； 所述的引物对ACTB为： 上游引物，ACTB-F:5' - GAGAGAAGATGACACAGAC -3' ； 下游引物，ACTB-R:5' - GTCCATCACAATACCAGTGG -3'。 一种用于检测(基因127bp deletion可变剪接体的试剂盒，所述试剂盒包括引物 对P、引物对ACTB、2 X SYBR?Premix Ex Taq? II和去RNA酶的超纯水。
[0006] 一种检测[基因127bp deletion可变剪接体的的方法，包括以下步骤： (1) 以待测cDNA为模板，以引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR (简称qPCR，下 同）扩增内参基因，以引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增基因127bp deletion可变剪接体，所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2XSYBR?Premix Ex Taq? II 9~11 ii L，去 RNA 酶的超纯水 7~8 ii L，引物 P-F 或 ACTB-F0. 5~1 ii L，引物 P-R 或 ACTB-RO. 5~1 ii L，cDNA 模板 0? 5~1. 5iiL 构成，其反应方法是 92~96 °C 预变性 4~6min， 92~96°C变性 8~12s，55~65°C退火 25~35 s，70~74°C延伸 25~35s，35~45 个循环； (2) 对步骤（1)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用CT相对 定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。
[0007] 本发明还提供了所述的引物对P和引物对ACTB在检测(基因127bp deletion 可变剪接体中的应用。
[0008] 本发明还提供了所述的试剂盒在检测基因127bp deletion可变剪接体中的 应用。
[0009] 本发明利用特异性引物将基因的127bp deletion可变剪接体从该基因的多 种剪接形式中分离出来，对蓮因127bp deletion可变剪接体的表达水平进行定量分 析，准确、快速、方便，具有很强的适用性。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明方法流程示意图； 图2为本发明中组织样的熔解曲线图； 图3为本发明中基因127bp deletion剪接体的相对定量结果图。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0012] 由图1所示，本发明在具体实施中是由以下技术方案实现。
[0013] 一种用于检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的引物，包括引物对P和引 物对ACTB， 所述的引物对P为： 上游引物，P-F :5' - CTTGTGAACGATCGCATGTG -3' ； 下游引物，P-R:5' - GTGGTATCTTAACTGCAAGG -3' ； 所述的引物对ACTB为： 上游引物，ACTB-F:5' - GAGAGAAGATGACACAGAC -3' ； 下游引物，ACTB-R:5' - GTCCATCACAATACCAGTGG -3'。 该引物有效用于制备检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的试剂盒。
[0014] -种用于检测[基因127bp deletion可变剪接体的试剂盒，所述试剂盒包括 引物对P、引物对ACTB、2XSYBR?Premix Ex Taq?n和去RNA酶的超纯水，该试剂盒有效用 于检测[基因127bpdeletion可变剪接体。
[0015] 一种检测(基因127bpdeletion可变剪接体的的方法，包括以下步骤： (1) 以待测cDNA为模板，以引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩增内参基 因，以引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增基因127bp deletion可变剪接体，所 述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2XSYBR?Premix Ex Taq?n 9~lliiL，去RNA酶 的超纯水 7~8 ii L，引物 P-F 或 ACTB-F0. 5~1 ii L，引物 P-R 或 ACTB-R0. 5~1 ii L，cDNA 模板 0. 5~1. 5 ii L构成，其反应方法是92~96°C预变性4~6min，92~96°C变性8~12s，55~65°C退火 25~35 s，70~74°C延伸 25~35s，35~45 个循环； (2) 对步骤（1)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用CT相对 定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。
[0016] 所述的反应体系包括有2XSYBR?PremixExTaq?II10.0 iiL，去RNA酶的超纯水 7. 4 iiL，引物P-F或ACTB-F0. 8 iiL，引物P-R或ACTB-R0. 8 iiL，cDNA模板 1. 0 iiL构成，其 反应方法是94°0预变性51^11，941：变性1〇8,6〇1：退火3〇8,721：延伸3〇8,40个循环。
[0017] 所述步骤（1)中引物对ACTB的扩增产物长度为116bp，引物对P的扩增产物长度 为 131bp。
[0018] 所述步骤（2)中采用相对定量方法计算该剪接体的相对表达量=