一种用于融合蛋白的连接肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于融合蛋白构建的连接肽,以及编码其的DNA分子。 技术背景
[0002] 重组蛋白技术已经成为了目前获取大量目的蛋白质的有力手段。利用基因重组 等分子生物学和细胞生物学手段,将编码目的蛋白质产物的基因组装到大肠杆菌或其它原 核、真核生物的蛋白质表达平台上,就能够大量、高效的表达所需要的蛋白质。同时,通过调 整、改造蛋白质表达平台的元件,如启动子、终止子、操纵子、核糖体结合位点等,以及优化 密码子,能对蛋白质的表达量进行按需调控。另外,根据突变实验的结果,或者结合生物信 息学、结构生物学等,可以直接对蛋白质的氨基酸序列进行修改,进而设计和改造原有蛋白 质的功能和结构。可以说,重组蛋白技术是人们研究蛋白质性能和利用蛋白质的重要基础。
[0003] 融合蛋白技术是以蛋白质重组技术为基础发展起来的一项技术,在科学研究和生 产领域都有广泛的应用。融合蛋白是指通过某种方式将两个原本由单独的基因编码的蛋白 质(或蛋白质的结构域)实现分子水平的连接而获得的新型蛋白质。目前融合蛋白主要是 通过将编码目的蛋白质(或蛋白结构域)的基因,利用分子生物学方法,连接而得到融合蛋 白的编码基因,进而在蛋白质表达平台上进行融合蛋白的表达。构建融合蛋白的形式主要 有两种,即首尾相接的串联融合和插入融合,而由于插入融合难度实现难度相对较大,目前 应用中主要以串联融合为主。
【发明内容】
[0004] 通过构建融合蛋白,可以实现蛋白质的多功能化。蛋白质往往具有其独特的生物 学功能,如催化多种化学反应、调控其它蛋白质的活性、帮助蛋白多肽链的翻译后折叠以获 得天然的三、四级结构等。通过合理的设计,将具有不同功能的蛋白质进行融合,能获得满 足人们需要的多功能蛋白质。融合蛋白技术目前已得到广泛的应用。如通过将绿色荧光蛋 白和目标蛋白进行融合,可以实现对目标蛋白的可视化跟踪;在此基础上,结合荧光共振转 移技术,更能对蛋白质-蛋白质相互作用进行研究。另外,将对某种介质具有特异的亲和吸 附特性的蛋白质和需要纯化的蛋白质进行融合,可以实现蛋白质的一步纯化,可以大大简 化常规的蛋白质纯化流程;通过对融合位点进行合理设计,可以利用特定的蛋白酶对目标 蛋白质以外的部分进行切割,获得高纯度的天然蛋白质。将催化多步反应的蛋白质(酶) 构建融合蛋白,能减少反应中间产物的扩散效应、缩短其传递距离,极大的提高整体反应速 率。在典型的酶制剂生产-应用的过程中,往往需要经过发酵_细胞破碎-分离纯化-催化 等步骤,其中分离纯化中需要多种方法结合使用,才能从细胞裂解物中获取纯度较高的酶, 步骤繁多。同时,在发酵和催化过程中需要对酶的活性进行必要的监控。这些都导致酶制 剂的生产使用成本高,不利于其推广应用。利用融合蛋白技术,通过构建具有荧光_亲和吸 附-催化等多功能的三重融合蛋白质,能够实现酶的一步纯化,且催化能在固定介质上原 位进行,同时荧光能作为酶催化活性的实时指标,可以减少酶活测定的步骤。利用融合蛋白 技术,通过过程集成的思想,极大的降低了酶制剂的生产成本,提高了生产效率。
[0005] 然而,构建融合蛋白的过程中也会遇到各种问题,例如在单独表达时能正确折叠 的蛋白质在融合蛋白中不能正确折叠;融合的两个蛋白质因为空间距离靠近从而导致活性 位点的屏蔽;融合蛋白分子因不能正确折叠或其构象的原因而容易被蛋白酶降解;原本具 有一定柔性的蛋白质催化域在融合之后失去了原有的功能;等等。这些问题的出现,往往导 致融合蛋白活性的损失甚至完全失去。一般认为,构建融合蛋白后,原有蛋白质的活性会有 一定程度的下降;一个有意义的融合蛋白其各部分的活性应该在原有蛋白质的50%以上。
[0006] 为了解决以上问题,人们对融合蛋白的设计和构建进行了研究和探索,以提高融 合蛋白的活性。如通过改变融合蛋白的首尾顺序,变换不同的融合位点,采用不同的融合方 法,或者采用连接肽等方法。虽然这些方法都有成功的例子,但对于如何设计融合蛋白的构 建策略,没有明确的理论指导,更多的是根据经验进行设计,通过试错的方式检验其效果。 另外,这些方法没有普适性,对于特定的蛋白质来说,需要进行试验来确定其合适的构建策 略。这些都制约了融合蛋白的发展和利用。
[0007] 相比其它融合策略,使用连接肽(linker)具有多种优势。第一,组成连接肽的氨 基酸具有多样性(20种常见氨基酸),而且连接肽的长度也是可调参数之一,由此可以带 给连接肽丰富的多样性(20的n次方种,n是连接肽的氨基酸残基数),有利于对其进行工 程改造;连接肽能为两个蛋白质提供一定的空间间隔,以有利于其顺利折叠而不相互干扰; 连接肽能为两个蛋白质提供相互作用的可能性,利于相互间协同作用。
[0008] 有不少文献报道了连接肽序列对于融合蛋白构建和表达的影响。例如,在构建单 链抗体1F7的研究中,发现采用一个常规的Genex212连接肽(GSTSGSGKSSEGKG)来连接其 轻链和重链时,不能获得蛋白质原有的催化活性,且蛋白质不稳定;通过构建具有随机序列 的连接肽(18个氨基酸残基)的库进行筛选,才获得了具有活性的单链抗体。有研究者构建 了绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白的融合蛋白(GFP-BFP),通过改变其连接肽的序列及长度, 能影响GFP和BFP蛋白之间的空间距离。另外,研究者发现登革热病毒的NS28蛋白(一个 N端为丝氨酸蛋白酶,C端为RNA解旋酶,连接肽是一段11个氨基酸残基的多肽),通过在 原173和174位点氨基酸残基之间插入甘氨酸残基,以及将174位的脯氨酸替换成甘氨酸, 均导致两端蛋白质活性的显著下降,表明其天然连接肽所具有的长度和刚柔性是长期进化 的结果,对该天然融合蛋白的功能具有重要意义。
[0009] 但是目前对设计和构建连接肽的方法中还存在诸多问题(1)设计缺乏明确的指 导原则,往往根据经验原则和实验基础,且针对某个融合蛋白的连接肽不具有普适性;(2) 虽然连接肽序列可更改由此带来很大的多样性,但实际上使用的连接肽种类有限,制约了 连接肽的应用。上述问题直接影响了所述方法在融合蛋白构建表达上的应用。
[0010] 因此,本领域迫切需要开发出更丰富的、更适用于融合蛋白构建和表达的连接肽, 且这些连接肽具有广泛的适用性和可移植性,以克服现有技术的缺陷。
[0011] 本发明的目的在于提供一种用于融合蛋白的连接肽,其涉及如下方面:
[0012] 1?一种连接肽,其组成如下式(1)所示:
[0013] (F)n(R)m (1)
[0014] 其中,n和m为0~5的整数,且满足2彡n+m彡5,F表示氨基酸序列为GGGGS (Seq ID N0:1)的柔性单元,R表示氨基酸序列为EAAAK(Seq ID N0:2)的刚性单元,
[0015] 上述式⑴中F和R各自独立地以任意顺序排列。
[0016] 2.根据项1所述的连接肽,其中,n+m=2,所述连接肽为FF(Seq ID N0:3)、RR(Seq ID N0:4)、FR(Seq ID N0:5)或 RF(Seq ID N0:6)。
[0017] 3.根据项1所述的连接肽,其中,n+m=3,所述连接肽为FFF(Seq ID N0:7)、FFR(Seq ID N0:8)、FRF(Seq ID N0:9)、RFF(Seq ID N0:10)、FRR(Seq ID N0:ll)、RFR(Seq ID N0:12)、RRF(Seq ID N0:13)或 RRR(Seq ID N0:14)。
[0018] 4.根据项1所述的连接肽,其中,n+m=4,所述连接肽为FFFF(Seq ID N0:15)、 FFFR(Seq ID N0:16)、FFRF(Seq ID N0:17)、FRFF(Seq ID N0:18)、RFFF(Seq ID N0:19)、 FFRR(Seq ID N0:20)、FRRF(Seq ID N0:21)、RRFF(Seq ID N0:22)、FRFR(Seq ID N0:23)、 RFRF(Seq ID N0:24)、RFFR(Seq ID N0:25)、FRRR(Seq ID N0:26)、RFRR(Seq ID N0:27)、 RRFR(Seq ID N0:28)、RRRF(Seq ID N0:29)或 RRRR(Seq ID N0:30)。
[0019] 5.根据项1所述的连接肽,其中,n+m=5,所述连接肽为FFFFF(Seq ID N0:31)、 FFFFR(Seq ID N0:32)、FFFRF(Seq ID N0:33)、FFFRR(Seq ID N0:34)、FFRFF(Seq ID N0:35)、FFRFR(Seq ID N0:36)、FFRRF(Seq ID N0:37)、FFRRR(Seq ID N0:38)、FRFFF(Seq ID N0:39)、FRFFR(Seq ID N0:40)、FRFRF(Seq ID N0:41)、FRFRR(Seq ID N0:42)、FRRFF(Seq ID N0:43)、FRRFR(Seq ID N0:44)、FRRRF(S