包含额外的二硫键的胰岛素衍生物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年6月21日的中国专利申请201180031021. 4"包含额外 的二硫键的胰岛素衍生物"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及包含额外的二硫键的胰岛素衍生物及其制备方法。
【背景技术】
[0003] 糖尿病是代谢病，在这种病中，利用葡萄糖的能力部分或完全丧失。在糖尿病的 治疗中，已经提出并使用了许多种胰岛素制剂，如常规胰岛素、低精蛋白锌胰岛素（指定为 NPH)，胰岛素锌悬浮液（如Semilente1''、Lcntc'Hlltralcntck.)以及两相低精蛋白锌 胰岛素。
[0004] 人胰岛素由两个多肽链组成，即A和B链，其分别包含21个和30个氨基酸残基。 A和B链通过两个二硫键相互连接。来自大多数其它物种的胰岛素是相似的，但在一些位置 可能包含氨基酸取代。在过去十年内，已经开发了许多人胰岛素类似物。它们是设计用于 特定的作用模式，即快速作用或延长作用。包括这种胰岛素类似物的商业上可获得的产品 包括Levemir?、NovoRapid?、Humalog?、Apidra?和Lantus?。
[0005] 多种蛋白酶的作用使人胰岛素在胃肠道的内腔中迅速降解，限制了其吸收进入循 环系统。当与天然胰岛素相比，亲水的并且对蛋白水解性降解稳定的胰岛素类似物在动物 模型中表现出更高的生物利用度。
[0006] 将二硫键引入蛋白是改善蛋白稳定性一种天然方式：已经发现二硫键的丰度和 嗜热生物体间最高的生长温度之间的相关性，暗示了高温环境中二硫键在蛋白稳定中的重 要性〇\&1111。1^?，等，2002，？1'〇。.恥七1.八。&(1.5(^.旧八，99,9679-9684.:1^(16118七61111?，等， 2006, FEBS J.，273,4170-4185)。也有许多成功地将二硫键工程化进蛋白并伴随稳定性增 加的例子。对于芽孢杆菌RNAse获得了一种最高的稳定作用（Clarke J.，Fersht A.，1993， Biochem. ,32,4322-4329)。通过增加解折叠（unfolding)所需的活化能，或者通过约束蛋 白的解折叠的构象从而降低它们的构象熵，带来了这种稳定作用（Pace C. N.，1990，Trends Biol. Sci.，14-17)。然而，在这个新兴的研究领域，需要学习的多得多。至今，没有胰岛素 中工程化的二硫键的报道。
[0007] 仍然需要稳定的新的胰岛素衍生物。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及具有两个或更多个半胱氨酸取代和连接于胰岛素的侧链的胰岛素衍 生物，其中保留人胰岛素的三个二硫键，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱 氨酸残基位于折叠的胰岛素衍生物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多 个额外的二硫键的形成。
[0009] 在一个方面，获得了本发明的胰岛素衍生物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方 式使得（1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素衍生物的三维结构中，以允许不存在于 人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，以及（2)胰岛素衍生物保留了与人胰岛素 相关的期望的生物活性。
[0010] 在一个方面，获得了本发明的胰岛素衍生物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方 式使得（1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素衍生物的三维结构中，以允许不存在于 人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，（2)胰岛素衍生物保留了与人胰岛素相关 的期望的生物活性，以及（3)胰岛素衍生物相对于人胰岛素和/或没有一个或多个额外的 二硫键的胰岛素衍生物增加了物理稳定性。
[0011] 在一个方面，获得了本发明的胰岛素衍生物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方 式使得（1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素衍生物的三维结构中，以允许不存在于 人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，（2)胰岛素衍生物保留了与人胰岛素相关 的期望的生物活性，以及（3)胰岛素衍生物对蛋白水解性降解是稳定的。
[0012] 本文中还描述了用于稳定胰岛素衍生物的方法，包括用半胱氨酸残基取代胰岛素 的两个或更多个氨基酸并且将侧链连接于胰岛素，其中
[0013] a.保留人胰岛素的三个二硫键，以及
[0014] b.选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素 衍生物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，
[0015] 从而产生胰岛素衍生物，其包含不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫 键。
【具体实施方式】
[0016] 本发明中，提供了新的胰岛素衍生物，其中将二硫键工程化进胰岛素衍生物。
[0017] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生物具有两个或更多个半胱氨酸取代，保留了人 胰岛素的三个二硫键。
[0018] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生物具有侧链。在一个方面，侧链连接于赖氨酸残 基的S氨基。在一个方面，侧链连接于B-链中赖氨酸残基的 e氨基。
[0019] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生物具有两个或更多个半胱氨酸取代，保留的人 胰岛素的三个二硫键以及连接于如B-链中的赖氨酸残基的 e氨基的侧链。
[0020] 在本发明的一个方面，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基 位于折叠的胰岛素衍生物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的 二硫键的形成。
[0021] 本发明人已经发现，本发明的胰岛素衍生物具有改善的物理稳定性。因此已经发 现，例如，类似物暴露于热-机械应激和/或与不稳定的界面和表面如疏水表面和界面的相 互作用导致的本发明的胰岛素衍生物形成胰岛素类似物的无生物活性的和/或不溶性的 聚集体的趋势降低。
[0022] 本发明的人胰岛素衍生物结合于胰岛素受体。本发明人已经惊讶地发现，本发明 的人胰岛素衍生物既具有改善的物理稳定性又保留与胰岛素受体的结合。
[0023] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生物，即包含一个或多个额外的二硫键，比没有一 个或多个额外的二硫键的相似胰岛素衍生物更持效。"更持效"在本文中意味着它们具有 更长的清除半衰期，或者换言之，持续延长的期间即更长的作用持续时间的胰岛素效应。因 此，本发明人已经惊讶地发现，与没有一个或多个额外的二硫键的相似胰岛素衍生物相比， 包含一个或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物可以具有长清除半衰期，或者换言之，持续 延长的期间即持效的作用持续时间的胰岛素效应。
[0024] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生物针对蛋白水解性降解，即针对胃肠（GI)道中 或身体其它部位的快速降解，是稳定的。在一个方面，相对于没有一个或多个额外的二硫键 的胰岛素衍生物，本发明的胰岛素衍生物针对蛋白水解性降解是稳定的。
[0025] 针对蛋白水解性降解稳定的胰岛素衍生物在本文被理解为胰岛素衍生物，相对于 人胰岛素，其经受一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在一个实施方案中，相对于人胰岛素， 本发明的胰岛素衍生物经受一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在本发明的进一步的实施 方案中，本发明的胰岛素衍生物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：胃蛋白酶 (如，例如，同种型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶（如， 例如，同种型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶（IDE)， 弹性蛋白酶（例如，同种型胰腺弹性蛋白酶I和/或II)，羧肽酶（例如，同种型羧基肽酶 A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，组织蛋白酶D及源自大鼠、猪或人的肠提取物中存在 的其它酶。
[0026] 在一个实施方案中，本发明的胰岛素衍生物针对一种或多种酶的降解是稳定的， 该酶选自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶（IDE)，弹性蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶和组织 蛋白酶D。在进一步的实施方案中，本发明的胰岛素衍生物针对一种或多种酶的降解是稳 定的，该酶选自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本发明的胰岛素衍生 物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和IDE。在仍进一步的实施方案 中，本发明的胰岛素衍生物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和羧肽 酶。
[0027] "蛋白酶（protease) "或"蛋白酶（protease enzyme) "是消化酶，其可以使蛋白 和肽降解，并且可以在人体的各种组织中发现它，例如胃（胃蛋白酶），肠腔（糜蛋白酶，胰 蛋白酶，弹性蛋白酶，羧肽酶，等）或胃肠道的粘膜表面（氨肽酶，羧肽酶，肠肽酶，二肽基肽 酶，内肽酶，等等），肝（胰岛素降解酶，组织蛋白酶D等），和其它组织中。
[0028] 可以如实施例102中所述测定T1/2作为本发明的胰岛素衍生物对蛋白酶如糜蛋 白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A或者对酶的混合物如组织提取液（来自肝，肾，十二指肠， 空肠，回肠，结肠，胃，等）的蛋白水解稳定性的量度。在本发明的一个实施方案中，相对于 人胰岛素，T1/2增力卩。在进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的胰 岛素衍生物，T1/2增加。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T1/2增加至少2倍。 在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物，T1/2增 加至少2倍。在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T1/2增加至少3倍。在仍进一步 的实施方案中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物，T1/2增加至少3倍。 在仍进一步的实施方案中，相对于人胰岛素，T1/2增加至少4倍。在仍进一步的实施方案 中，相对于没有一个或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物，T1/2增加至少4倍。在仍进一 步的实施方案中，相对于人胰岛素，T1/2增加至少5倍。在仍进一步的实施方案中，相对于 没有一个或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物，T1/2增加至少5倍。在仍进一步的实施方 案中，相对于人胰岛素，T1/2增加至少10倍。在仍进一步的实施方案中，相对于没有一个 或多个额外的二硫键的胰岛素衍生物，T1/2增加至少10倍。
[0029] 在一个方面，本发明的胰岛素衍生