体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外培养肝样细胞的方法以及采用该方 法培养的优化后肝样细胞。
【背景技术】
[0002] 肝脏是决定药物代谢和毒性作用的主要器官，也是多种病毒性肝炎、肝脏肿瘤疾 病的靶器官。目前，在制药工业界，原代肝细胞（包括人和动物原代肝细胞）因其药物代谢 酶和药物转运体的表达和新药研发以及临床现象有比较好的相关性，被称为药物动力学研 究的黄金标准，同时也是肝移植和生物反应器的宝贵资源（Sinz,Wallaceetal. 2008)。目 前原代肝细胞的国际市场保守估计在20亿美元。但是，原代肝细胞不能传代，多种蛋白质 表达下降，加上价格昂贵和供体依赖性，限制了它在科研和临床上的进一步使用。因此，无 论是科研还是制药工业实践中迫切需要一种功能与肝细胞类似、可稳定传代、可靠且易得 的功能性肝细胞。
[0003] 2010年的FDA白皮书首次指出，药物转运体在新药研发中具有和药物代谢酶同等 重要的地位，并且规定了 7种必须考察的药物转运体，其中有5种药物转运体在肝脏的代 谢、解毒中起到重大作用（InternationalTransporter,Giacominietal. 2010)。这一内 容在2012年FDA药物相互作用指南中被确定了下来。
[0004] 但是，目前可以获得的类似肝脏细胞的细胞株有各种缺点，尤其是没有具备合适 的药物转运体表达，无法用于肝脏相关的药物肝胆分布和代谢、毒性研究。例如，最通用的 肝脏来源细胞株H印G2上面几乎没有重要的药物转运体表达，更不用说胆管类似结构了。 目前公认最接近原代肝细胞的细胞株H印aRG，虽然药物代谢酶CYP3A4表达较为丰富并且 可以诱导，但是其药物转运体表达仅仅有Pgp得到承认，而且通过免疫组化试验显示，不能 达到极化表达（Andersson,Kanebrattetal. 2012)(参见附图 4)。
[0005] 近年来，许多体外试验证实可将胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞分化为肝样 细胞，但是，这些技术受供体来源（来自于胚胎的ES细胞）和诱导产生过程高成本和复杂 性（来源于人类上皮细胞的iPS细胞，需要进行转分化三部曲）所限，无法提供合适的肝 样细胞用于药物研发（Jensen，Hyllneretal. 2009)。虽然有多篇文献报道这些细胞具备 了一定的药物代谢酶表达，但是对于药物转运体的表达鲜有报道，而且无法令人满意。目前 国际上最新的直接转分化技术，可以将小鼠成纤维细胞分化成鼠源诱导肝样细胞（induced hepatocyte-likecell，iHep)。虽然iHep在形态、功能和应用上和现有细胞系相比有很多 优点，但是，iHep在转运体的表达方面并没有显著提高（图1)。在药物转运体和胆酸合成分 泌方面并不成熟，没有形成药物转运体的极化表达和可以检测的胆酸合成分泌能力。事实 上，胆酸的合成分泌和药物的解毒能力是成熟肝细胞的重要标志。实验数据显示，在现有的 iHep细胞中，药物转运体及胆酸相关的合成酶和转运体的表达量与其在小鼠原代肝细胞中 的表达量相比极低，仅为5-10%(图1)。类似地，采用直接转分化技术也可以由人源非肝脏 细胞获得人源诱导肝样细胞（humaninducedhepatocyte-likecell,HiHep)，但该细胞也 同样具有上述缺陷。
【发明内容】
[0006] 技术问题
[0007] 2011年，Nature上发表论文，在世界上首次提出可以利用表观遗传学手段，直接 将小鼠的鼠尾纤维细胞转分化成肝样细胞（HuangPY，HeZY，JiSY，SunHW，XiangD，et al. (2011)Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblasts bydefinedfactors.Nature475:386_U142.)。相对于原代肝细胞，通过上述直接转分化技 术产生的肝样细胞的来源不受供体资源的限制，理论上可以在保持遗传性状的基础上无限 传代。它们不仅具有肝脏细胞的多项生理特征和功能，而且具有清楚的遗传背景和一定的 药物代谢酶表达。因此具有取代原代肝细胞，成为用于药物研发和临床实践的新细胞模型 的潜力。
[0008] 但是，该细胞株仅具备初步的药物转运体和胆酸代谢酶表达，而各种相关蛋白质 并没有在细胞膜上极化分布。FDA2012年发布的药物相互作用指南上明确指出，只有药物转 运体在肝细胞膜上极化表达，细胞才可能具备胆酸盐极化摄取、分泌能力，这是评价肝样细 胞的重要特性。
[0009] 因此，在现有技术中，例如，无论是将胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞分化为肝 样细胞还是利用例如直接转分化技术获得的肝样细胞均没有形成药物转运体的极化表达 和/或可以检测的胆酸合成分泌能力。在本申请中，将采用现有技术（包括直接转分化技 术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术）将动物源非肝脏细胞或人源非肝脏细胞 获得的肝样细胞定义为传统肝样细胞，其没有形成药物转运体的极化表达和/或可以检测 的胆酸合成分泌能力，在功能和形态上与原代肝细胞具有显著的差别。
[0010] 为提高现有技术(包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技 术）产生的传统肝样细胞中胆酸合成酶、胆酸转运体和药物转运体的表达和功能，本申请的 发明人通过多次试验，产生了适用于现有技术(包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功 能干细胞诱导分化技术）产生的传统肝样细胞的特殊体外培养方法。该方法有效刺激由现 有技术(包括直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术）产生的传统肝 样细胞的进一步分化、胆酸合成酶表达和相关药物转运体极化分布，从而使传统肝样细胞 具备和原代肝细胞类似的胆汁摄取、分泌能力，药物转运体极化表达，从而可以用于相关科 研工作。
[0011] 因此，本发明的一个目的为提供一种对采用现有技术获得的传统肝样细胞进行体 外培养的方法。具体地，所述方法能够进一步促进传统肝样细胞的生长和分化并提高药物 转运体、胆酸转运体和/或胆酸合成酶的表达水平和极化表达。
[0012] 本发明的另一个目的为提供一种优化后肝样细胞，所述优化后肝样细胞内胆酸合 成酶、胆酸转运体和药物转运体的表达大幅度提高，并且功能接近原代肝细胞。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明提供一种传统肝样细胞的体外培养方法，其包括：
[0015] 步骤1、采用三明治（sandwich)细胞培养法培养传统肝样细胞，S卩：将传统肝样细 胞接种在含鼠尾胶原I的24孔板上，加上普通培养基，培养细胞24-48小时后，铺上基质 胶，形成三明治培养结构，继续培养24-48小时；
[0016] 步骤2、撤除原有普通培养基，换用诱导培养基继续培养3-5天，获得优化后肝样 细胞；
[0017] 其中，所述诱导培养基为无血清培养基的基础上补加诱导剂，即普通培养基撤除 1%的胎牛血清，并且补加cAMP(环腺苷酸）、3MC(3-甲基胆蒽）、PB(苯巴比妥）、TCA(牛黄胆 酸）和VPA(丙戊酸)中的至少一种核受体激动剂，上述各核受体激动剂在所述诱导培养基中 的浓度范围分别为cAMPl-10iiM、3MC1-10iiM、PB10-200iiM、TCA5-50iiM和VPA0. 2-4iiM;
[0018] 优选地，所述诱导培养基含有选自cAMP、3MC、PB和TCA中的两种或三种，进一步 优选地，所述诱导培养基含有浓度为2yM的cAMP和浓度为50yM的PB，或者含有浓度为 2iiM的cAMP、浓度为2iiM的3MC和浓度为50iiM的PB，或者含有浓度为2iiM的cAMP、浓 度为2iiM的3MC、浓度为5