一种l-色氨酸的提取新工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及L-色氨酸生产技术领域，具体涉及一种L-色氨酸 的提取新工艺。
【背景技术】
[0002]L-色氨酸的分子式为CnH1202N 2,分子量为204. 21，含氮13. 72%。L-色氨酸是含 有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈絹丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味，水中溶解度 1. 14g/L(25°C )溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、 乙醚。
[0003]L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发 育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三 大饲料添加氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料行业。
[0004]近年来，随着国内饲料工业的发展和L-色氨酸及其代谢产物研究的深入，尤其是 随着我国老龄化程度不断加重，L-色氨酸在医药行业上的用途也不断扩大。目前，L-色氨 酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。
[0005]目前，L-色氨酸的生产方法主要有4种：（1)蛋白质水解法：主要从含有相对丰富 的L-色氨酸的废蚕丝、毛发和血粉等蛋白质原料通过酶水解或碱水解法来提取L-色氨酸。 蛋白质水解法工艺复杂，生产周期长，产品成分复杂，现在使用较少。（2)化学合成法：化学 合成主要以苯阱为原料或者以吲哚为原料合成，合成之后为DL-色氨酸，在经过拆分得到 L-色氨酸。这种方法原料成本高，工艺复杂，工业推广差。（3)酶促转换法：利用微生物产 生的L-色氨酸合成酶系转化前体合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影 响较严重，底物L-丝氨酸价格较高，吲哚水溶性较差，转化率不高。（4)发酵法：是指利用 L-色氨酸高产菌种，采用葡萄糖等廉价碳源做原料，控制合适的发酵条件，从而获得L-色 氨酸产品的一种方法。发酵法已经成为当前工业生产L-色氨酸的重要方法。
[0006] 从发酵液中提取L-色氨酸是发酵法生产L-色氨酸的关键工序，现有的提取工艺 主要存在以下三个方面的问题。第一方面：传统的提取工艺主要采用粗品制备精品，在制备 过程中需要两次结晶，耗费大量的试剂，并需要增加工序去除这些试剂；这不仅增加了工艺 的复杂性和工作量，还会造成不必要的生产浪费。第二方面：采用活性炭对L-色氨酸进行 脱色，产生大量的废水和活性炭废料。第三方面：菌株产氨基酸效率低。
【发明内容】
[0007]本发明需要解决的技术问题是，克服了现有技术中存在的不足之处，提供了一种 L-色氨酸的提取新工艺，该工艺操作简单，产率和纯度高，能够实现废物利用，并且合理配 伍菌株，大大提高了发酵效率，可大规模推广使用。
[0008]本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
[0009] 一种L-色氨酸的提取新工艺，其包括如下步骤：
[0010] 步骤1):将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养至浓度为1 x 108个/mL的菌液，按 照2 : 1的体积比混合得到混合菌液，然后按照2%接种量接种到发酵培养基中，发酵培养 30小时，得到L-色氨酸发酵液；
[0011] 步骤2):将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60°C，用盐酸调节调pH值为 4,经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；
[0012] 步骤3):步骤2)所得滤过液经过三柱串联离子交换柱，得到L-色氨酸高浓液；然 后用盐酸调节L-色氨酸高浓液的pH值为3,最后进行超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有 色素及蛋白的浓缩液；
[0013] 步骤4):将步骤3)所得色氨酸超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色 氨酸料液；将上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅浓缩得到L-色氨酸浓缩液；
[0014] 步骤5):将步骤4)所得L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集 上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；
[0015] 步骤6)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液以及步 骤5)所得上清液合并得到废弃料液，然后往废弃料液中添加豆柏、酒糟、水稻秸杆粉 以及麦麸，2000rpm搅拌lOmin，通入蒸汽升温至100°C，蒸馈30分钟；然后将蒸馈物烘 干，粉碎机粉碎制得饲料；其中，废弃料液、豆柏、酒糟、水稻秸杆粉以及麦麸的质量比为 100 : 4 : 3 : 2 : 1。
[0016] 优选地，
[0017] 所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2. 5g/L、硫酸铵 2g/L、梓檬酸2. 5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸猛5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫 酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0? 9mg/L。
[0018] 所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30°C，工作压力：进压为3bar，出压 为lbar。所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，截留分子量为600-1000KDa，操作温度 5〇°C，压力为 0? 25Mpa。
[0019] 所述反渗透膜为聚酰胺复合膜。
[0020] 本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
[0021] 本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用两种菌液按照一定比例混 合，各菌株之间具备一定的协同作用，比常规的单一菌株发酵方法，能够大大提高色氨酸的 发酵产量。本发明采用三柱串联离交柱提取L-色氨酸，其生产工艺简洁，便于操作和维护， 占地面积少，可连续工业化生产。
[0022] 本发明采用超滤脱色技术，脱色过程简单，脱色效果明显；与传统活性炭脱色所产 生大量工业废水和活性炭废料相比，减轻废水处理负担，节省了工业成本。
[0023] 本发明在提取色氨酸过程中，对菌体蛋白、大分子多糖等进行回收利用，几乎无废 水外排，避免此类物质的废液对环境造成的污染，绿色环保；而且获得了营养丰富的菌体蛋 白饲料，变废为宝，增加经济效益。
【具体实施方式】
[0024] 为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具 体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0025] 实施例1
[0026] -种L-色氨酸的提取新工艺，其包括如下步骤：
[0027]步骤 1):将大肠杆菌（Escherichia coli)ATCC 27325 (可参见 Appl. Environ. Microbiol. October 1994vol. 60no. 10, 3724-3731)和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 (Journal of Biotechnology, V104,September 2003,Pages5-25) 分别培养至浓度为1X108个/mL的菌液，按照2 : 1的体积比混合得到混合菌液，然后按照 2% (v/v)接种量接种到发酵培养基（葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸镁2. 5g/L、硫酸铵 2g/L、梓檬酸2. 5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸猛5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫 酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0? 9mg/L)中，温度37°C，溶氧控制20%，罐压0? 05MPa， PH7. 0,当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段，流加葡萄糖液浓度为 600g/L，液氨调节pH控制在7. 0,色氨酸浓度可以达到50g/L，葡萄糖转化率为18. 8%。待 色氨酸生成速率明显下降，残糖浓度上升为1. 〇g/L时，结束发酵；整个发酵过程时间为30 小时；
[0028] 本发明采用菌株组合，配伍合理，大大提高了色氨酸葡萄糖转化率和缩短发酵时 间，有利于工业化；色氨酸含量采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典（Ph Eur monograph 1272);同时在其他条件不变的前提下，检测了单一大肠杆菌发酵色氨酸浓度， 仅为33g/L，葡萄糖转化率为17. 1%。
[0029] 步骤2):将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60°C，用盐酸调节调pH值 为4,经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为 30°C，工作压力：进压为3bar，出压为lbar;
[0030] 步骤3):步骤2)滤过液进入三柱串联离交柱，柱中填充阳离子交换树脂柱 (001 X 7)，吸附温度为30°C，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节上述L-色氨酸高浓液 的pH值为3,超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；所述超滤膜器采 用聚酰胺管式