一种西瓜基因表达的实时荧光定量pcr分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因表达分析技术领域，具体涉及西瓜基因表达的实时荧光定量PCR 分析方法。
【背景技术】
[0002]实时焚光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR，简称qRT-PCR)是 基因表达定量分析中的常用技术，是分子生物学研宄中不可缺少的重要研宄手段，它是基 于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)和反转录技术发展起来。
[0003] 在基因表达分析过程中，首先要提取样本的RNA，然后反转录成CDNA，之后再以 cDNA为模板，利用目标基因的特异引物，采用qRT-PCR技术对基因表达进行定量分析。由于 提取RNA过程中通常会有基因组DNA污染，所以反转录成cDNA之前，需要利用相关的酶来 降解RNA样品中的基因组DNA(简称为gDNA)。但对于缺乏经验的实验人员而言，通常会遗 漏去除gDNA的步骤，导致进行基因表达的定量分析时，除了扩增出cDNA上的基因片段外， 还可能扩增了 gDNA上的目标片段，从而大大增加了基因的表达量，导致结果错误。此外，即 使利用酶切的方法降解gDNA，也不能完全消除酶切后的小片段gDNA对表达结果的影响。因 为，有些gDNA上的假基因可能只是被酶切成了小片段，并没有被完全降解，这些假基因与 对应的能表达的基因在序列上是一样的，因此，同样可能扩增出这些假基因的片段，导致目 标基因的表达水平被尚估。
[0004] 目前在基因引物设计过程中，研宄人员通常是在获取目标基因的序列后，利用 Primed等引物设计软件设计基因的特异引物，再将之用于基因的表达分析。这种引物设计 方法并不考虑引物在基因上的结合位点，我们将这种方法称为随机结合位点的引物设计。 利用这种方法设计出来的引物虽然能保证扩增出目标基因，但也可能在cDNA和gDNA上都 能扩增出相同大小的片段。因此，无法在基因表达分析过程中排除gDNA污染和假基因的影 响，从而使基因表达水平被高估，导致结果错误。所以，基因表达分析中需要一种新的引物 设计方法，来排除可能的gDNA污染和假基因的存在对基因表达分析的影响，保证结果的准 确性。
【发明内容】
[0005] 在利用qRT-PCR进行基因表达分析过程中，为排除cDNA样品中gDNA污染和假基 因片段对表达结果造成的影响，克服一般基因引物设计方法的缺陷，确保基因表达分析结 果的准确性，本发明提供了专门用于西瓜基因表达分析中一种跨相邻外显子接头位点引物 的设计方法，利用该方法设计的基因特异引物可以使实验结果不受cDNA样品中存在gDNA 污染以及假基因片段的影响。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的原理是：位于gDNA上的基因表达时，先转录成前 体mRNA，前体mRNA经过编辑形成成熟的mRNA，然后成熟mRNA再翻译成蛋白，执行相应的生 物功能。在前体mRNA的编辑过程中一个重要内容就是切除前体mRNA上的内含子。因此， 基因的成熟mRNA序列与其DNA序列相比就只有外显子而没有内含子。如将基因的特异引 物设计在两个相邻的外显子的接头位点，那么以cDNA为模板时能扩增出目标基因的片段， 而在gDNA上，由于相邻两个外显子接头位点被内含子分隔，导致以gDNA为模板进行PCR扩 增时引物无结合位点，就无扩增产物。因此，基因表达分析时，即使cDNA样品中有gDNA的 污染或则假基因的片段，由于无法扩增而克服了其对基因表达结果的影响。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 从萌芦科基因组数据库（http://www. icugi. org)获取目标西瓜基因的完整序列 和结构信息；根据目标基因结构信息，确定外显子的接头位点；采用Primer3Plus (http:// primer3plus. com/cgi_bin/dev/primer3plus. cgi)进行引物设计，将两个相邻外显子序列 接头位点上下游15bp的序列用" "标识，限制基因的一个引物在这个两个相邻外显子结 合位点区域进行设计，然后将扩增产物大小设为80_150bp，以满足qRT-PCR的要求；分别以 cDNA和gDNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如在cDNA模板上扩增出了目标片段，而 在gDNA模板上无扩增产物，则引物设计正确，用该引物对目标基因的表达进行qRT-PCR分 析；如扩增失败，则选择另外的外显子结合位点按照上述方法重新进行引物设计。
[0009] 本发明的特点在于：在进行基因表达分析时，根据基因的结构进行引物设计，将引 物与模板的结合位点特异地设置在跨相邻外显子的接头位置，使其只能在CDNA模板上扩 增出目标片段，而在gDNA模板上无扩增产物，从而有效地克服了 cDNA样品中存在的gDNA 污染对基因表达分析结果的影响。利用该方法成功设计了西瓜果实中类胡萝卜素生物合成 及代谢途径中重要的调控基因类胡萝卜素过氧化氢裂解酶基因（CCD1)和胡萝卜素羟 化酶基因（CHYB)的跨外显子接头特异性引物。
[0010] 本发明的优点是：
[0011] (1)准确性。克服了基因表达分析中传统引物设计方法的缺陷，本发明设计的跨相 邻外显子接头位点的基因引物，在表达分析中可以不受到cDNA样品中存在的gDNA污染和 假基因片段的干扰，从而有效保证了基因表达分析结果的准确性。
[0012] (2)实用性。利用本发明设计的引物由于在gDNA上无扩增产物，所以在cDNA样品 制备过程中，可以不需加相关的酶去除gDNA，从而节约了实验成本；同时，对于未知的cDNA 样本也不需要检测是否存在gDNA的污染，而直接可以用于基因表达分析。因此，本发明不 仅使用范围广，而且能节约实验成本，具有很大的实用性。
【附图说明】
[0013] 图1:西瓜(XD1基因结构不意图。
[0014] 图2:西瓜(XD1基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板cDNA结合及扩 增示意图。
[0015] 图3:西瓜ran基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板gDNA结合及扩 增示意图。
[0016] 图4:西瓜(XD1和CHYB基因引物PCR扩增的特异性电泳检测结果。
[0017] 图5:西瓜(XD1基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量的qRT-PCR分析结果。
[0018] 图6 :西瓜CHYB基因结构示意图。
[0019] 图7 :西瓜CHYB基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板cDNA结合及扩 增示意图。
[0020] 图8 :西瓜CHYB基因PCR扩增时跨外显子接头位点的引物与模板gDNA结合及扩 增示意图。
[0021] 图9:西瓜CHYB基因在西瓜果实成熟过程中的相对表达量的qRT-PCR分析结果。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1西瓜ran基因跨相邻外显子接头位点引物的设计及其表达分析
[0023] (1)西瓜(XD1基因序列和结构信息的获得：
[0024] 类胡萝卜素过氧化氢裂解酶基因（CCD1)的序列参考文献GrassiS，PiroG，Lee JM，etal.Comparativegenomicsrevealscandidatecarotenoidpathwayregulators ofripeningwatermelonfruit[J].BMCgenomics，2013, 14(1): 781。从朝芦科基因组数 据库（ http://www.icugi.org/)下载该基因的序列及基因结构信息（ID:Cla015245)，基因 序列见SEQIDN0. 5,结构信息见图1。
[0025](2)ran基因随机结合位点引物设计：
[0026] 当前进行基因表达分析时，在对目标基因进行引物设计的过程中，通常都是将基 因的CDS序列放到引物设计软件中进行引物设计，这种方法并不考虑引物在基因上的结合 位点，我们将这种方法称为随机结合位点的引物设计。为说明我们发明的跨相邻外显子接 头位点引物设计方法的可靠性，我们同时也利用随机结合位点的引物设计方法对CCD1基 因进行了引物设计，并作为对照。随机结合位点的引物设计过程为：将CCD1基因的CDS序列 放入Primer3Plus软件，选用qPCR默认参数，产物长度设为80-150bp，点击Pick primers， 选用排在第一位的引物对，序列见表1。将获取的引物序列和CCD1基因的CDS序列进行比 对，发现该引物对位于第1个外显子上，即该引