一组特异识别蜡样芽孢杆菌的寡核苷酸适配子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX 技术（指数富集的配体系统进化技术）筛选一种与蜡样芽孢杆菌高特异性和高亲和力的寡 核苷酸适配子，为该核酸适配子在检测蜡样芽孢杆菌中的应用提供科学依据和理论基础。
【背景技术】
[0002] 赌样芽孢杆菌（Bacillus cereus)是一种在自然界分布广泛的食源性致病菌，常 存在于土壤、灰尘和污水中，植物和含淀粉较多的各类生熟食品中，已从包括肉、乳制品、蔬 菜、鱼、土豆、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等在内的多种食品中分离出该菌，蜡样芽胞 杆菌作为一种食源性致病菌的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，据我国食品污染 物和食源性疾病监测网络统计，2003年，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒的 4.0%，为细菌性食物中毒的第四位。当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>10 6个时可导 致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒是该菌产生的肠毒素所致，在临床上可分为呕吐型和 腹泻型两类。产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引 起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。呕吐型的潜伏期为0. 5-6小时， 中毒症状以恶心、呕吐为主，偶尔有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的 症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期6-15小时，症状以水泻、 腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜 梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。因此，建立一种快速、灵敏、准确的蜡样芽 孢杆菌检侧方法对保证食品供应链安全和保障人类健康显得尤为重要。
[0003] 蜡样芽孢杆菌的检测方法包括生物学检测、分子生物检测、免疫学检测等。传统的 细菌培养和生化鉴定操作繁琐、耗时；分子生物学检测方法如PCR方法虽然快速、准确，但 其影响因素复杂，且易受操作条件的影响，重复性差且无法保证其特异性；免疫学检测具有 特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程复杂，耗时长，制备出的抗体稳定性 差，易受温度等环境因素的影响。
[0004] 适配子是通过SELEX技术从体外合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选得到的 能够与靶物质特异性结合的一簇小分子单链DNA或RNA序列。SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集的配体系统进化技术） 是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研宄核酸结构和功能的有效方 法，其基本原理是体外合成一个随机单链寡核苷酸文库与靶物质混合，得到靶物质-寡核 苷酸复合物，去除未与靶物质结合的寡核苷酸分子，分离能与靶物质结合的寡核苷酸分子 作为模板进行PCR扩增，得到的扩增产物进行下一轮的筛选，通过数轮重复筛选与扩增，富 集得到与靶物质高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。如今，适配子已经 广泛地应用于如靶标检测、酶抑制，受体调节和药物传递等各种领域。与蛋白类抗体相比， 适配子表现出极大的优势，如特异性高，、亲和力强，不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫 原性的限制，适配子筛选完全在体外进行，筛选周期短，合成方便且成本低，可以再合成时 精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，适配子变性与复性可逆且速度快，稳定好，受环 境条件影响小，可反复使用、长期保存。随着SELEX技术的不断完善进步，适配子已经广泛 用于不同的靶标，如小分子物质（有机染料，金属，药物，碳水化合物，氨基酸，核苷酸和肽 等）、蛋白质（包括酶、抗体、基因调控因子，以及外源凝集素）、肿瘤细胞、病毒和致病菌等。 Cel 1-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉 淀从而分离出结合和未结合的寡核苷酸分子。近几年，已成功米用Cell-SELEX技术筛选出 大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌的适配子，基于 Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配子已经成为当前的研宄热点。
[0005] 本发明以易引起"炒饭综合症"的完整的活性蜡样芽孢杆菌为靶标，采用活 Cell-SELEX技术筛选出蜡样芽孢杆菌的高特异性和高亲和性的适配子，稳定性高、合成方 便、易标记功能基团和报告分子，将广泛应用于食品安全检测、环境样品中蜡样芽孢杆菌的 快速检测。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种微生物的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配 子技术快速、准确检测蜡样芽孢杆菌的方法。
[0007] 本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术（SELEX技术），以完整的活性 蜡样芽孢杆菌细胞为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配子Spl5、 Spl6,可以通过荧光基团标记方法将获得的适配子转为检测探针，用于环境样品、食品中蜡 样芽孢杆菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。
[0008] 本发明的优点：
[0009] (1)与抗体相比，适配子可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基 团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。
[0010] (2)该组序列是从结构显著、与蜡样芽孢杆菌结合具有不同亲和力的8条适配子 序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列，能够特异识别痢疾志贺氏菌。
【附图说明】
[0011] 图1是蜡样芽孢杆菌8个适配子家族代表性序列的二级结构图谱。
[0012] 图2是蜡样芽孢杆菌适配子Sp7、Spl4、Spl5、Spl6亲和力饱和结合曲线。
[0013] 图3是蜡样芽孢杆菌适配子Sp7、Spl4、Spl5、Spl6的特异性图。
[0014]表1是蜡样芽孢杆菌适配子解离常数。
【具体实施方式】：
[0015] 下面是通过cell-selex技术筛选高特异性、高亲和力的蜡样芽孢杆菌核酸适配 子及其快速检出蜡样芽孢杆菌方面的应用。
[0016] 1、合成随机单链DNA文库和引物（IDT公司合成）
[0017]随机单链 DNA 文库：5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGT GAA-3'，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的 随机序列，库容量达到1〇 14以上；上游引物：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3' ;