一种多肽、其应用及包含该多肽的药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种多肽、其应用及包含该多肽的药物。
【背景技术】
[0002] 牙周病被认为是由牙菌斑导致的牙周组织破坏的疾病。大量的研究表明牙龈卟啉 单胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.g)是人类牙周疾病重要的致病菌，该菌是革兰阴性 菌、产黑色素、不酵解糖、分解蛋白的专性厌氧类杆菌，是慢性牙周炎病变区或活动进展区 最主要的优势菌，其致病因子主要有脂多糖、蛋白酶、血凝素、菌毛及膜泡。牙龈卟啉单胞菌 的新陈代谢和毒力需要卟啉和铁，但是其本身缺乏合成卟啉和铁的能力，必须从外界摄取， 研究也证实了牙龈卟啉单胞菌通过从外界获取血红素为自身提供卟啉和铁，在炎症性牙周 袋病变区，血红蛋白成为了血红素卟啉和铁的来源。
[0003] 美国和澳大利亚学者发现血凝素2 (hemagglutinin-2,HA-2)在牙銀卟啉单胞菌 与血红蛋白、血红素的结合中发挥重要的作用。HA-2又称为血红蛋白受体（hemoglobin receptor，HbR)、高相对分子质量牙銀素（highmolecularmassgingipain，Hgp_15)。HA-2 基因是牙龈卟啉单胞菌的胰酶样蛋白酶基因血凝素结构域HA-l、HA-2、HA-3和HA-4四部分 的第2部分。
[0004] 许多研究都发现，HA-2不仅能结合血红蛋白的血卟啉，还能直接与血红素结合，并 只和卟啉环结合，而不像某些蛋白直接结合铁离子。例如，张荃等研究发现慢性牙周炎患者 龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌HA-2的DNA和RNA水平的检出率达85%，HA-2DNA水平的基因 量与牙周探针深度及牙龈指数具有正相关关系，揭示了HA-2基因广泛存在于慢性牙周炎 患者的龈下菌斑中，且可能参与了牙龈卟啉单胞菌的致病。牙龈卟啉单胞菌自发的非黑色 变异株，kgp基因中包含编码HA-2区域的变异株，其与血红蛋白和氯化高铁血红素的结合 能力下降了 50%。撤_2特异性抗体免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)能50%阻断HA-2 与血红蛋白或血红素的结合，证实了HA-2蛋白是牙龈卟啉单胞菌细胞表面结合血红蛋白 或亚铁血红素的主要参与者。研究还发现HA-2抗血清抑制了牙龈卟啉单胞菌与血红蛋白 的结合，也说明了HA-2参与了牙龈卟啉单胞菌与血红蛋白的结合。有研究学者通过对牙龈 卟啉单胞菌的细胞表面提取物进行研究，发现了HA-2与血红素具有高亲和力，主要参与与 血红素的结合，从而提供细菌生长和毒力所需要的卟啉和铁元素部分。而Paramaesvaran 等证实了牙龈卟啉单胞菌细胞表面的HA-2以高亲和力与血红蛋白的血卟啉结合。这些都 表明HA-2参与了牙龈卟啉单胞菌与血红蛋白、血红素的结合。
[0005]Nguyen等用ELISA法检测人血清抗rHA-l、HA-2、HA-3和HA-4的抗体水平发现，血 清抗HA-2抗体水平远低于HA-4、HA-3及HA-1。血清抗HA-1、HA-3和HA-4抗体滴度与慢 性牙周炎严重程度无关，提示抗HA-1、HA-3和HA-4的抗体可能不具有保护性。抗HA-2的 血清抗体滴度很低不易测出，且经治疗后，一些慢性牙周炎患者血清HA-2抗体水平升高， 提示了患者抗HA-2抗体的缺乏可能是牙周病发生、发展的一个重要因素。DeCarlo等对人 血清抗重组HA-2特异抗体水平进行分析，发现血清中抗HA-2抗体IgG的滴度与牙周健康 及附着丧失之间存在负相关关系，推测可能是因为该抗体具有中和牙龈卟啉单胞菌捕获血 红蛋白的能力。治疗后血清抗HA-2抗体IgG的滴度直接与牙龈卟啉单胞菌蛋白酶kgp结 合血红蛋白的中和能力相关，治疗后血清IgG对牙銀卟琳单胞囷蛋白酶kgp结合血红蛋白 的中和能力低下与重度牙周炎的发生有直接关系，以上结果揭示了HA-2抗体对牙周病的 免疫保护作用。DeCarlo等用rHA-2免疫大鼠预防了牙龈卟啉单胞菌感染所引起的牙槽骨 吸收，说明了rHA-2作为牙周病疫苗抗原的潜在应用价值。
[0006]目前，研究已证实了牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿、牙 髓感染等口腔疾病的发生、发展中发挥着重要的作用。同时，研究还表明，牙龈卟啉单胞菌 存在于全身组织中，可引起全身性疾病，例如心脑血管疾病和肺部感染等全身系统性疾病， 抑制牙龈卟啉单胞菌药物的开发将有助于预防及治疗由牙龈卟啉单胞菌引起的全身性疾 病。因为牙龈卟啉单胞菌HA-2直接参与了牙龈卟啉单胞菌与血红蛋白、血红素的结合，所 以针对HA-2的抑制剂在制备抑制牙龈卟啉单胞菌的药物上具有一定的优势，但是目前还 没有相关的抑制剂，所以急需一种能够特异性抑制HA-2活性的抑制剂，来抑制HA-2与血红 蛋白、血红素的结合，进而阻断牙龈卟啉单胞菌摄取卟啉和铁，最终达到防治相关疾病的目 的。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种多肽、其应用以及包含该多肽的药物。 该多肽能够抑制重组HA-2蛋白与氯化血红素的结合，抑制牙龈卟啉单胞菌的生长，可以应 用于制备防治由牙龈卟啉单胞菌引起的疾病的药物。
[0008] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
[0009] 本发明提供了一种多肽，其具有如（I)、（II)所示的氨基酸序列中任意一个：
[0010] ⑴具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列；
[0011](II)具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基 酸获得的氨基酸序列。
[0012] 研究发现牙龈卟啉单胞菌HA-2具有与血红蛋白、血红素或氯化血红素结合的功 能，但是HA-2与氯化血红素结合的位点是未知的。本发明通过多肽内切酶消化重组HA-2 蛋白，获得多肽片段之后，进行多肽的氨基酸序列分析，并结合HA-2突变重组蛋白的氯化 血红素结合功能测定，最终确定了HA-2的1001位组氨酸参与了重组HA-2与氯化血红素的 结合。具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列为HA-2氨基酸序列中第1000位至第1008 位所对应的氨基酸序列，该序列包含HA-2的第1001位组氨酸，氯化血红素结合抑制实验证 实了具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列的多肽能够有效抑制重组HA-2蛋白与氯化血 红素的结合，体外抑菌实验证实了该多肽能够抑制牙龈卟啉单胞菌的生长，能够应用于制 备防治由牙龈卟啉单胞菌引起的疾病的药物中的应用。
[0013] 优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经取代一个或 多个氨基酸获得的氨基酸序列时，取代氨基酸的个数为1个、2个、3个、4个或5个。
[0014] 优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经取代一个或 多个氨基酸获得的氨基酸序列时，被取代的氨基酸为天门冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨 酸或赖氨酸。
[0015] 优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列经添加一个或 多个氨基酸获得的氨基酸序列时，添加氨基酸的个数不少于1个。
[0016] 更为优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经添加一 个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，添加氨基酸的个数具体为1个、2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个13个或14个。
[0017] 更为优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经添加一 个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，添加氨基酸的个数具体为1个、2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个。
[0018] 更为优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经添加一 个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，当添加氨基酸的个数具体为6个时，本发明提供的 多肽的氨基酸序列不为具有如SEQIDN0 :10所示的氨基酸序列。
[0019] 更为优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经添加一 个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，当添加氨基酸的个数为9个时，本发明提供的多肽 的氨基酸序列不为具有如SEQIDN0 :11所示的氨基酸序列。
[0020] 更为优选地，本发明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列经添加一 个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，当添加氨基酸的个数为5个时，本发明