一种提取海洋微藻油体的蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物技术领域，具体为通过分离纯化微藻油体及油体相关蛋白，对微藻油脂代谢，油体膜生物合成，膜运输和信号转导机理进行研究。
【背景技术】
[0002]随着化石能源的日趋枯竭和生态环境的日渐恶化，可再生且清洁的生物能源的研究开发已成为近年来的热点话题，海洋微藻具有种类多、固定CO2光合作用效率高、生物产量高、生长周期短及自身油脂含量高、不占耕地、易于人工控制等优点，被认为是制备生物柴油最佳的生物质能源原料之一。微藻积累大量油脂以甘油酸三酯(triacylglyeerols, TAG)的结构忙存在胞衆油体中，油体外部包被一层磷脂单分子层，以及镶嵌其中或附着其上的油体相关蛋白质。这些蛋白或是油体结构蛋白，或是其它发挥生物学功能蛋白，在油体形成、稳定以及油脂代谢利用过程中起着关键作用。
[0003]目前在多种生物体中中已经发现并解析了油体相关蛋白，在动物和真菌中分离得到油体相关蛋白属于PAT家族，如Perilipin、ADRP, TIP47等；植物油因其特殊营养贮存形式也被选作过生物柴油原料，种子植物油体研究日渐成熟，油体成分主要是甘油酸三酯TAG，磷脂PL和油体相关蛋白。内部液态基质为TAG，外围包裹一层磷脂单分子层，磷脂疏水基团与TAG相互作用，亲水基团暴露在油体外层，油体表面亲水。组成膜的蛋白质主要是油体蛋白Oleosins,有保守区域:Pro_knot motif,中间72个连续非极性残基包括三个pro残基和一个ser残基，PX5SPX3P。后来也发现短链残基Oleolike，二者在维持油体稳定性方面发挥重大作用，随后的Caleosin、Steroleosin也被发现。Oleosin保守区域在JGI/NCBI中查找，发现没有能编码oleosin不等鞭毛藻-棕藻/金藻/硅藻/卵藻以及等鞭毛藻；Oleolike在绿藻中有，MLDP (major LD protein)则在微藻中普遍存在。
[0004]提取微藻油体，进而纯化油体相关蛋白，通过解析油体蛋白质生理生化特性，研究磷脂膜蛋白结构功能，阐明微藻在胁迫条件下积累油体过程，油脂代谢和油体变化机制，深入了解微藻产油机理，改良微藻品种，提高油脂含量和油脂组分，为更好利用第三代生物能源海洋微藻提供理论基础。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种提取纯化微藻油体及其相关蛋白的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种提取微藻油体的蛋白的方法:
[0007]( I)利用高压、超声、研磨或高渗破碎藻细胞后，油体因其密度低与其它亚细胞器经超速离心后分离，油体浮在所有水相梯度顶层，收集油层，洗涤，具体为分离缓冲液中加Λ 0.6-1.0M蔗糖，保护胞内细胞器，利用高弗式压碎器15000-20000psi破碎微藻细胞，选择蔗糖梯度、离心速率或离心力，油体直径在0.5-5um之间，收集顶层油体，洗涤；
[0008](2)将油脂和蛋白分离，用氯仿:甲醇(V/V1:2)或2-4倍体积冷丙酮12-20h，-20°C处理油体，离心，收集油相和沉淀；0.P/oSDS复溶沉淀蛋白，冻干，即可得到目的蛋白。
[0009]利用研磨(Beads shocker/Beadbeater)破碎微藻细胞,显微镜观察藻细胞破碎情况，测破碎后上清蛋白浓度，计算破碎率。
[0010]利用超声破碎微藻细胞，功率在3-100W，超声5s，间隔1-5S，超声l_5min。
[0011]利用高渗破碎微藻细胞，将耐盐微藻从高盐营养液中转移到无盐缓冲液中，温和破碎且不破碎其它亚细胞器，然后再利用密度梯度离心分离纯化油体。
[0012]分离缓冲液可以用(λ 15M tricine-KOH缓冲液或25-50mMHEPES-K0H缓冲液或10-20mM MOPS 或 PBS 或 Tris-HCl 缓冲液，pH 在 7.0-8.0 之间；缓冲液中加入 KC1、MgC12、EDTA, EGTA, DTT,高浓度蔗糖以及PMSF或Cocktai I蛋白酶抑制剂。
[0013]蔗糖梯度为1.0Μ、0.6Μ、0.4Μ、0.2M、0M 或 30%、20%、10%、5%、0 ;离心力在10，000g-150, OOOg ;离心时间 30min-2h
[0014]步骤(I)整个过程在4°C条件下进行。
[0015]以海洋微藻等鞭金藻(Isochrysis zhanjianggensis,属于金藻门、普林藻纲、等鞭藻目、等鞭藻科、等鞭藻属)为例，+N/-N培养微藻，收集缺氮后ld，2d，3d，4d，5d藻细胞，含高浓度蔗糖匀浆缓冲液研磨/超声破碎细胞，加入等体积低浓度蔗糖缓冲液，离心，收集最上层油体层；高PH缓冲液洗涤，除去污染蛋白或膜，镜检油体纯度及完整度，评估油体提取效率；氯仿:甲醇(V/V1:2)或2-4倍体积冷丙酮过夜沉淀富集油体蛋白，收集油相；0.P/oSDS复溶沉淀蛋白，变性电泳SDS-PAGE，从电泳条带上找到纯化目的蛋白，+N/-N及-N后不同天内发生变化的蛋白条带，切胶，LC-MS/MS，根据质谱结果设计合适抗体，通过Western blot定量分析,缺氮负氮时哪些油体相关蛋白表达发生了变化,缺氮后几天里蛋白量是增加还是降低，进一步验证
[0016]油体相关蛋白生理生化特性。
[0017]本发明的优点如下:
[0018]1.研究了海洋微藻体系在不同生长条件下油体积累变化，发现微藻中油体相关蛋白在油体积累过程中所起作用。
[0019]2.提取纯化过程简单易行，藻细胞破碎程度高，油体完整度得以保证，可以得到高纯度、有生物活性油体；能拿到全部油体相关蛋白，分析数据可靠，结果可重复。
[0020]3.对有无细胞壁微藻油体及相关蛋白提取均适用。
【附图说明】
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[0021]图1微藻生长过程中油脂积累:单位体积细胞密度、叶绿素荧光、单位细胞Nilered荧光强度随生长天数变化；
[0022]图2金藻细胞破碎前后显微镜观察结果；
[0023]图3密度梯度离心后顶层油体；
[0024]图4提取油体Nile red染色图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。
[0026]本发明以海洋微藻湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis,藻种来自FACHB藻种保存中心)为实验材料，在光照生物反应器通入4%C02，3Xf/2培养，3d缺氮，收集不缺氮以及缺氮后3d、4d、5d、6d、7d、8d藻细胞。
[0027]实