肝素，置4°C冰箱备用。
[0079] 实施例2从经血中分离间充质干细胞（离心法）
[0080] 经血样品和采集液混合液用100ym细胞滤网（品牌：BD;货号：352360)进行过 滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。用血细胞计数 仪对单个核细胞进行计数。
[0081] 收集单个核细胞，并进行细胞扩增、纯化和冻存。
[0082] 1、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入人 淋巴细胞分离液（TBD)之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温条件下用台式离心机 800g离心15分钟。
[0083] 2、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗 涤2-3次。
[0084] 3、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并计 数，以1X106细胞/ml的密度接种至I75(75cm2)培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数 为5%的C02培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞。
[0085] 4、细胞扩增和纯化，待上述步骤单个核细胞培养的4~5天后，更换完全培养基， 并弃除未贴壁细胞；以后每3~4天全量换液一次；待细胞生长达到80 %~90 %融合时，用 质量浓度为〇. 25 %的胰蛋白酶消化收集细胞，进行细胞的冻存，或按5000-6000个/cm2密 度传代接种培养，并记为P1代。
[0086] 5、鉴于经血干细胞比较大，比其他来源的间充质干细胞大，所以冻存的数目为100 万以上每管。具体步骤：消化前用PBS洗3遍，用质量百分含量为0. 25%的胰蛋白酶消化 收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1~2*106/ml;用细胞计数仪计 数。将上述被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行冻存，冻存步骤如下：
[0087] 第一步：4°C，等待；
[0088] 第二步 1. 0°C/ 分钟降至-3. 0°C;
[0089] 第三步5. 0°C/分钟降至-20. 0°C;
[0090] 第四步1.(TC/分钟降至-40.(TC;
[0091] 第五步5.(TC/分钟降至-90.(TC;
[0092] 第六步结束；
[0093] 取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。
[0094] 完全培养基配制：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mLMEM-alpha培养基、20mL ChangB基液、1~3mLChangC基液、1~3mL青霉素或者链霉素、1~3mL浓度为200mM 的L-谷氨酰胺、10~20mL的胎牛血清，充分混勾，置4°C冰箱待用。
[0095] 冻存液配制：7份完全培养基、2份血清/血清替代物、1份DMSO。
[0096] 实施例3实施例2中获得的间充质干细胞鉴定、表征和特异性标志物分析
[0097] 取实施例2中P5代的间充质干细胞，用相应的抗体标记，用流式细胞仪分析，鉴 定间充质干细胞表面标志物，结果如表1和表2所示。
[0098] 此外，除了用月事杯体内采集经血之外，以与实施例2相同的步骤进行采集、分离 和储存经血间充质干细胞。并取P5代的间充质干细胞进行相同的鉴定、表征和分析。
[0099] 经血间充质干细胞形态学可参见图3。P1 :细胞培养传代1代的经血干细胞，P5 : 细胞培养传代5代的经血干细胞；体内采集方法（A、C)，体外采集方法（B、D)。体外采集所 获取的经血干细胞形态均一性好，比体内采集方法所获取的细胞密度更高。
[0100] 经血干细胞核型分析可参见图4。（左）体内采集方法，（右）体外采集方法。核 型无异常变化。
[0101] 以下表一示出了两种采集方法（从50岁女性）所获得的经血干细胞表面标志物 比较。
[0102] 表一.两种采集方法（从50岁女性）所获得的经血干细胞表面标志物比较
【主权项】
1. 一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括： a. 体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液； b. 从经血混合液分离单个核细胞； c. 贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞， 即经血间充质干细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： d. 将步骤c中经纯化的细胞冻存在冻存液中得到冻存样品； 优选的是，所述方法还包括： e. 将步骤d中的冻存样品放入液氮中以长期保存。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中使用尿液采集器例如尿杯进行体外 收集经血。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经血采集液为：每100mlHank's平衡 盐溶液中，含有以下成分：万古霉素80yg/mL、头孢氨节300yg/mL、卡那霉素120yg/mL、 庆大霉素150yg/mL、两性霉素B3yg/mL及450单位肝素； 优选的是，所述经血采集液还含有0. 5-1.OmM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和低于 0. 8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E- 64以及0. 3-0. 75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA; 更优选的是，所述经血采集液还含有〇. 8mM的AEBSF和0. 5mM的E- 64以及0. 5mM金 属蛋白酶抑制剂EDTA。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中的经血混合液保存在冷冻状态，并 在72小时之内送往实验室进行细胞分离。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b如下进行：将采集管中的经血混合液 充分混匀后用100 U m细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离 心法，收集单个核细胞； 优选的是，步骤b如下进行： (1) 、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入人淋 巴细胞分离液（TBD)之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温条件下用台式离心机 800g离心15分钟； (2) 、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤 2-3 次； (3) 、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并计数， 以1X106细胞/ml的密度接种至I75(75cm2)培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分数为 5%的C02培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞； (4) 、在细胞培养3-4天后，更换完全培养基以弃除未贴壁细胞；初次换液后每天观察 细胞的生长情况，每3-4天全量换液一次。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c中的培养所述单个核细胞是将步骤 b(4)中获得的间充质干细胞培养基进行重悬，放入175的培养瓶中进行培养，培养条件为 37 〇C,5%C02 ； 优选的是，步骤c中的细胞扩增和纯化过程为：将步骤b中获得的单个核细胞培养的 4~5天后，更换完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3~4天全量换液一次；待细胞生 长达到80%~90%融合时，用质量浓度为0. 25%的胰蛋白酶消化收集细胞，可选地进一步 按5000-6000个/cm2密度传代接种培养，并记为P1代，从而得到纯化的经血间充质干细 胞。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤d如下进行：消化前用PBS洗3遍，用 质量百分含量为〇. 25%的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞 的密度为1~2*106/ml;用细胞计数仪计数，将上述被冻存液重悬的细胞冻存。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，将被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行 冻存，冻存步骤如下： 第一步：4°C，等待； 第二步1. 0°C/分钟降至-3. 0°C; 第三步5. 0°C/分钟降至-20. 0°C; 第四步1. 0°C/分钟降至-40. 0°C; 第五步5. 0°C/分钟降至-90. 0°C; 第六步结束。
10. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻存液为：7份完全培养基、2份血清/ 血清替代物和1份DMSO。
【专利摘要】本发明涉及一种新型的制备经血间充质干细胞的方法。所述方法包括：a.体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；b.从经血混合液分离单个核细胞；c.贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。本发明具有下述优点：对供体无损害、均一性强，细胞活力高，这体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104711220
【申请号】CN201510112156
【发明人】余艳春
【申请人】余艳春
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月13日