一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学技术领域。具体的，本发明涉及一种天然免疫细胞VS2T 的扩增培养数量的提高及方案的优化，是应用唑来膦酸与细胞因子联合诱导人VS2T细胞 的培养方法，可为该类细胞更广泛应用于临床肝癌细胞治疗提供坚实基础。
【背景技术】
[0002] yST细胞是T淋巴细胞的一大类，是Brenner于1986年应用T细胞受体的y基 因序列编码肽段所制备的抗体中首先发现的。yST细胞主要分布于皮肤和粘膜组织，而 在健康人外周血中YST细胞占淋巴细胞的1%~5%，其中VS2T细胞亚群主要占yST 细胞的50%-90% (经常和Vy9配对形成Vy9VS2T细胞），VS1T细胞亚群则占yST 细胞的10%-50%。该类细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性。人们发现yST细胞， 特别是其亚群VS2T细胞的（大多数是以VY9VS2T细胞状态存在时），在肿瘤免疫和抗 感染免疫中发挥了重要作用，成为重要的天然免疫防线。但由于YST细胞在外周血或组 织中含量不高，要获得大量高细胞毒活性的YST细胞必须进行体外的培养扩增。
[0003] 人们发现磷酸化抗原或小分子可以激活VS2T细胞亚群，而该亚群在动物模型和 多种难治性实体瘤以及病毒慢性感染疾病中被证明有杀伤肿瘤和抗病毒的作用。由于体外 磷酸化抗原等小分子可以在体内外激活YST细胞特异性杀伤肿瘤细胞，它们已经应用到 临床成为治疗肿瘤的一种新方式，免疫治疗安全性好并且可以延长肿瘤患者生存期，具有 显著的疗效。
[0004] 虽然有临床试验证明唑来膦酸联合rhIL-2直接输入癌症患者体内可以提高患者 机体的免疫力。但是为了达到该类细胞治疗理想的效靶比和长期有效性，还是有必要在体 外大量扩增后，进行多次回输。因此，有必要针对目前的体外诱导方案进行患者自身的外周 血单个核细胞的体外扩增，并通过联合加入rhIL-2提高其扩增效率和活性。目前使用的 YSTCR抗体体外刺激yST细胞扩增的研宄中，抗体价格昂贵，成本高，需要的外周血量 大，初始需要上亿个外周血单个核细胞进行扩增才能达到较好扩增效果；IPP的诱导则需 要在不同的时2-3次加入IPP，成本不高，但是扩增数量较低，扩增频率不高；结核杆菌耐热 性抗原体外诱导VS2T细胞的专利中指出其扩增后VS2T细胞纯度平均达80% ;用唑来 膦酸联合IL-2和达沙替尼的专利中指出改良后VS2T细胞纯度仅平均达80%，绝对数量 平均达到7X106。总之，虽然VS2T细胞的体外扩增技术有了较大发展，但是不同方法中仍 存在成本较高，需要患者血液量大和扩增效率有限或者纯度不高等缺点，制约了该类细胞 免疫治疗的推广。
[0005] 众所周知，rhIL-2是维持和扩增细胞的重要细胞因子。在VS2T细胞不同的体 外培养方案中，其加入的时点和量也有所差别。若过早加入rhIL-2则会使VS2T细胞以 外的细胞在早期大量扩增，加入过晚或是量不足则影响VS2T细胞的扩增效率和数量。因 此rhIL-2加入的时和剂量需要进一步摸索和确定。
[0006] 综上所述，如能在提高VS2T细胞扩增数量和功能的基础上，减少患者采血量，降 低成本，克服目前面临的主要障，将使该类细胞的免疫治疗手段进一步推广，更广泛地应用 于临床。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有VS2T细胞体外扩增方案中扩增效率有限，需血量 大等缺点，提供一种高效的体外大量扩增外周血VS2T细胞的方法，克服现有制备VS2T 细胞数量不足、扩增效率低、成本高的限制。为进一步提高VS2T细胞为基础的抗肿瘤免 疫治疗疗效提供支持。
[0008] 本发明通过以下步骤实现：
[0009] -种提高人VS2T细胞扩增效率的体外培养方法，包括如下步骤：
[0010] (1)分离外周血单个核细胞并使用培养基（AMV+10%FBS)制成细胞悬液，加入唑 来膦酸进行体外刺激；
[0011] (2)唑来膦酸刺激一天后，每天加入细胞因子rhIL-2 ;
[0012] (3)人外周血单个核细胞培养72-96h，培养液微变黄后半量或2/3量更换培养 液；
[0013] (4)96h后，培养液颜色变黄就进行半量换液；培养到第11-14天中，当扩增的VS2 T细胞频率和绝对数均达到要求时，收获细胞。
[0014] 所述唑来膦酸的使用浓度为3-10uM唑来膦酸加于1ml单个核细胞培养液悬液中， 细胞浓度为300-500万/ml。
[0015] 所述细胞培养当天加入唑来膦酸刺激，22-26h后加入rhIL-2,随后每天加入 rhIL-2〇
[0016] 所述rhIL-2的使用浓度为每ml单个核细胞悬液中加入50-200IUrhIL-2。
[0017] 所述细胞培养72-96小时之进行半量到2/3量更换培养液，并加入对应量的 rhIL-2 ;优选每ml细胞悬液50-200IU。
[0018] 96h后，所述根据细胞生长状态及培养液颜色变化进行半量换液，同时并补加对 应量的rhIL-2 ;优选每ml细胞悬液50-200IU。当VS2T细胞频率达到90%以上，绝对细 胞数达到3亿以上时即可收获细胞，一般是在第11-14天完成。
[0019] 在上述发明方法的基础上，我们针对上述的细胞扩增效率和纯度进行了评测：
[0020] Vs2T细胞扩增频率检测：使用流式的方法，检测第0、3、6、9、12天时VS2T细 胞扩增纯度；
[0021] VS2T细胞扩增绝对数。检测第0、3、6、9、12天时VS2T细胞绝对数，对不同天 数总的活细胞进行计数，乘以对应天数的VS2T细胞纯度，将上述两数相乘即得到VS2T 细胞的绝对数量。
[0022] 经过技术改进，我们发现，发明方案中唑来膦酸使用浓度为5uM/ml，rhIL-2使用 浓度为l〇〇IU/ml时，在培养的第12天时VS2T细胞纯度即达到93%以上，收获时总细胞 均能数达到3X108以上。以初始VS2T细胞绝对数为基数，扩增效率达到2300倍。（纯度 和绝对数量远远大于其他专利中描述的细胞平均纯度（80% )和绝对计数（7X106)增殖情 况，且培养时较某些专利研宄中的培养时（14-20天不等）缩短。
[0023] 在上述结果的基础上，我们将该项发明应用在乙肝肝癌患者中进行了体外细胞扩 增并进行了细胞特性的检测：
[0024] 我们检测了健康人和乙肝肝癌患者扩增后VS2T细胞表面活化分子、凋亡、NK类 似分子、颗粒酶、穿孔素及细胞因子分泌：于第12天收集体外培养的细胞，采用流式细胞 术检测两组人群扩增后，VS2T细胞表面活化分子：⑶38、⑶69 ;NK类似分子：⑶56、⑶16、 NKG2D、NKG2A;杀伤性颗粒：颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素；细胞因子IFN-y、TNF-a分泌表达 情况。以VS2T细胞⑶38阳性为例，计算公式为：⑶38+VS2T细胞表达（％ )=⑶38+VS2 T细胞/总VS2T细胞X100% ;
[0025] 总之，本发明通过应用和调整唑来膦酸和rhIL-2浓度和培养方案在体外诱导人 2T细胞的扩增，得到了诱导效率更高及活性更高的VS2T细胞。该方法具有如下特 点：培养方法简单，需要外周血量少，诱导细胞数量多，扩增效率极高，重复性好，经体外培 养后得到的细胞数量、活性以及功能上都与健康人扩增后无差异。有望提高目前VS2T细 胞免疫治疗肝癌疗效，具有很好的应用潜能。
【附图说明】
[0026] 图1:实施例1中，唑来膦酸和rhIL-2诱导人VS2T细胞体外扩增，不同天数VS2 T细胞占总细胞的频率。第0、3、6、9、12天使用流式细胞仪进行检测VS2T细胞纯度结果 如图，第十二天时即可达到90%以上。
[0027] 图2:实施例1中，唑来膦酸和rhIL-2诱导人外周血单个核细胞后，第0、3、6、9、12 天VS2T细胞的绝对计数图，显示的是不同培养时VS2T细胞的绝对数量统计分析图。
[0028] 图3:健康人（10个）和乙肝肝癌患者（10个）同样按实施例1方案条件扩增后， 第十二天收获细胞，进行不同的检测指标对比。包括活化指标、NK相关分子表达、颗粒酶穿 孔素分泌、干扰素和肿瘤坏死因子分泌。结果显示各指标均无显著差异。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
[0030] 基本方法如下：
[0031] 1、取10_15ml肝素钠抗凝外周血标本，应用人淋巴细胞分离液分离分离外周血单 个核细胞，使用培养基（AMV+10%FBS)制成细胞悬液，细胞浓度为300-500万/ml。将细 胞悬液接种于24孔板中，加入唑来膦酸（每ml细胞悬液加入3-10uM)进行体外刺激，将孔 板置于培养箱中培养；
[0032] 2、以接种天数为第0天，唑来膦酸刺激22-26小时后，细胞形态出现小团的细胞簇 形态时，以每ml细胞悬液50-200IU的浓度加入rhIL-2,此后每天以此浓度加入细胞因子 rhIL-2 ；
[0033] 3、人外周血单个核细胞培养72_96h小时后，细胞出现大量细胞簇形态，培养液微 变黄后进行半量到2/3量更换培养液，并加入对应量的rhIL-2 (每ml细胞悬液50-200IU rhIL-2)；
[0034] 4、96h后，所述根据细胞生长状态及培养液颜色变化（1-2天）进行半量换液，同 时并补加对应量的rhIL-2 (每ml细胞悬液50-200IU)。培养液颜色变黄就进行半量换液。 当细胞的形态大部分为长条状，VS2T细胞频率达到93%以上，绝对细胞数达到3亿以上 时即可收获细胞，一般是第11-14天。
[0035] 本实验所用外周血均来自天津市第一中心医院，本实验入组了十个健康人外周血 标本和十个乙肝肝癌患者的外周血标本。
[0036] 实施例1:VS2T细胞体外刺激扩增
[0037] 1.将获取的15ml肝素钠抗凝外周血1500rpmlOmin离血浆后，使用等量PBS缓 冲液充分混匀剩余的静脉血；在15ml离心管中小心加入4ml淋巴细胞提取液（注意不要 沾到管壁上），再将已经混匀的人血稀释液加入15ml离心管中，每管加入6ml;室温，600g， 30min，离心（离心机升