抗多环芳烃单克隆抗体与产生该抗体的杂交瘤细胞pyr#6-e4及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗多环芳烃单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞及其应用，特别是在多环芳烃检测试剂盒方面的应用。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是一大类广泛存在于环境中的有机污染物，由两个或多个芳香环构成。主要由煤，石油等有机物的不完全燃烧而产生。许多种类的PAHs及其代谢物可通过呼吸道和皮肤接触进入人体，对人体产生较强的致癌作用。
[0003]多环芳烃的监测和分析技术主要包括以下几个方面:
[0004]1、由于PAHs对环境造成的污染及对人类健康的威胁，一些国家都通过书面法律和法令规定了对多环芳烃的检测限值要求，包括欧盟76/769/EEC，德国GS认证，LFGB。美国国家环保局(USEPA)将16种PAHs (芘、荧蒽、苯并(b、k)荧蒽、芴、苯并芘、萘、菲、二苯并蒽、苯并蒽、苊、苯并茈、蒽、苊烯、屈、茚并芘)列为优先控制污染物，对其进行严格的监管和控制。我国国家标准(GB3092-1996、GB16297-1996、GB5749-85、GB4284-84、GB7104-94)中规定了空气、食品、饮用水等环境介质中多环芳烃的浓度限量。
[0005]2、不论是土样，水样，还是大气样，环境样品中PAHs的分析主要包括以下几个步骤:样品采集，PAHs提取，净化和浓缩，仪器分析。最常用的提取方法包括液液萃取，固液萃取，超临界萃取等，仪器分析方法主要是气相色谱法或高效液相色谱法。整个过程步骤繁琐，耗时较长，仪器设备昂贵，不适合对大量样品在短时间的分析和监测，并且在此过程中需要用到甲醇，二氯甲烷，丙酮等有机溶剂。除以上两种主要的仪器分析方法外，用于测定PAHs的方法还有荧光法和酶联免疫吸附分析法。与其它方法相比，酶联免疫吸附分析法具有特异性好，灵敏度高，操作简便快捷，且可同时处理大批量样品等忧点。
【发明内容】
[0006]本发明针对目前多环芳烃检测的不足之处，提供一种特异性和亲和力高的单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0007]本发明的思路在于采用多环芳烃完全抗原免疫动物，达到理想效价后进行细胞融合，从而筛选特异性较高的单克隆细胞株，该细胞株可以持续分泌单克隆抗体，便于进行多环芳烃的检出，从而为检测多环芳烃的酶联免疫试剂盒研发奠定了基础。
[0008]本发明的目的之一是提供一种特异性分泌多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2013年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.8552，分类名为多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0009]本发明的目的之二是提供一种用于制备抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，该方法包括如下的步骤:
[0010]1、动物免疫
[0011]免疫用小鼠为18g左右的BALB/C，7-8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60 μ g免疫原“PBA-BSA”，用生理盐水稀释到200 μ 1，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50 μ g蛋白/只小鼠。效价达到1:10000即可做细胞融合。
[0012]2、细胞融合
[0013]取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0，采用PEG法进行融合。融合后的细胞用含15%血清的IMDM培养基培养。
[0014]3、阳性细胞株筛选
[0015]用包被原“PBA-OVA”包板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作。
[0016]4、抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选
[0017]将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株PYR#6_E4接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用protein G亲和层析柱进行纯化,得到抗多环芳烃单克隆抗体，间接ELISA法检测纯化后抗体效价可达I X 105，采用竞争ELISA法对抗体进行鉴定，选择亲和力较高的抗体进行保藏。
[0018]更进一步的，上述步骤3和4中，所述竞争ELISA方法包括如下步骤:
[0019]以PBA-OVA包被酶标板，100 μ I/孔，4°C过夜；洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200 μ I/孔，加入竞争物(按照设计比例加入竞争物(芘)，50μ1/孔；加入一抗(抗血清纯化抗体按照选定比例稀释后加入)，50 μ I/孔，37°C孵育lh。设置空白对照和不抑制对照，洗涤2次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μ I/孔，37°C孵育lh，洗涤2次。加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入2mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。
[0020]本发明的再一个目的是提供由上述保藏号为CGMCC N0.8552的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该抗体具有高度的亲和性和特异性，能够与多环芳烃进行结合，从而进行检测。
[0021]本发明所提供的上述杂交瘤细胞株经保藏后可以稳定的分泌抗多环芳烃单克隆抗体，便于多环芳烃检测试剂盒的制备和规模化生产。
【附图说明】
[0022]图1是保藏编号为CGMCC N0.8552杂交瘤细胞株所分泌的抗体针对芘的间接竞争ELISA标准曲线。
具体实施方案
[0023]下面通过具体实施方案对本发明做进一步说明，但不意味着对本发明保护范围的限制。本领域内的技术人员在不脱离本发明的实质的前提下，对本发明进行适当的改进，包含反应体系，反应条件的改进和改动及替换都被视为包括在本发明的范围之内。
[0024]下述方案中所述方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业渠道购买。
[0025]实施方案
[0026]实验I保藏号为CGMCC N0.8552杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体制备
[0027]采用自制免疫原PBA-BSA免疫4只BALB/C小鼠，