说明。
[0035]如图1所示，一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤:
[0036](I)、培养基为:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸铜0.25g/L，吐温801mL/L，麦芽糖20g/L，缓冲体系为0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4 (ρΗ6.2 ?6.4)；
[0037]将培养基投入到生物反应器内，接种I % (v/v)沙克乳杆菌(Lactobacillussakei subsp.Sakei)(市售)到培养基上进行培养，培养温度为37°C，pH6.2?6.4，培养至单位菌落数107cfu/mL以上；
[0038](2)、对中空纤维浓缩装置的PVDF中空纤维膜进行清洗杀菌，清洗杀菌的步骤为:
[0039](a)、使用柠檬酸配制的pH为2的酸清洗液，利用水泵循环酸洗2次；
[0040](b)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性；
[0041](c)、使用碳酸钠配制的pH为12的碱清洗液，利用水泵循环碱洗2次；
[0042](d)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性；
[0043](a)、使用柠檬酸配制的pH为2的酸清洗液，利用水泵循环酸洗2次；
[0044](b)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性，吸取最后一次水洗后的溶液200 μ L涂布到平板计数琼脂培养基上，置于37°C下培养24h后计数，无菌落生长，表明杀菌效果良好，可使用；
[0045]将步骤(I)制得的菌液输至清洗杀菌后的中空纤维膜浓缩装置，在无菌状态下，利用真空泵进行中空纤维膜过滤浓缩，过滤除去代谢产生的对乳酸菌生长具有反馈抑制的乳酸、醋酸第物质，浓缩温度为25°C ±5°C，中空纤维膜孔径为0.1 μπι，膜过滤压力0.06MPa，膜过滤流速 250L/ (h.m2)；
[0046](3)、步骤(2)制得的浓缩菌液经中空纤维膜浓缩装置的浓水出口返回生物反应器，往浓缩菌液中注入新鲜灭菌的培养基，培养基同步骤(I)，新鲜培养基的体积为步骤(I)中培养基体积的1/2，培养温度为37 °C，pH6.2?6.4，培养至单位菌落数达到
2.84X 109cfu/mL ；
[0047](4)、步骤(3)获得的菌液按照步骤(2)中空纤维膜过滤浓缩方法过滤浓缩2次，每次过滤浓缩之后不再进行培养，获得单位菌落数达到7.49X10ncfu/mL的浓缩菌液；
[0048](5)、往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为:2%明胶、3%蔗糖、2%乳清蛋白；送入低温喷雾干燥器进行喷雾干燥，喷雾条件为:进风口温度为60°C，进样速度为18mL/min，制得微囊化乳酸菌发酵剂，经平板计数法检测微囊化乳酸菌发酵剂中单位活菌数为4.19X 10ncfu/mL。
[0049] 如图2-5，通过马尔文粒径分析仪(Mastersizer 2000)分析和电镜分析可知，微囊化乳酸菌发酵剂中菌体表面积的平均粒径为11.685 μ m ;体积粒径大小为5?60 μ m，体积平均粒径为28.125 μ m，90%的粒径大小分布在56.071 μ m以内，50 %的粒径分布在18.493 μπι,10%的粒径分布在5.347 μm以内，获得微囊粒径大小符合制粒要求，避免了当微胶囊粒径小5 μπι时，因布朗运动加剧而不容易收集；当粒径大于300 μπι时，其表面摩擦系数会突然下降而失去微胶囊作用。
【主权项】
1.一种微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)、乳酸菌接种到培养基上进行培养，乳酸菌的接种量为I?2%，为体积百分比，培养温度为37?42°C，pH6.2?6.4，培养至单位菌落数达到107cfu/mL以上； (2)、将步骤(I)制得的菌液进行中空纤维膜过滤浓缩得到浓缩菌液，浓缩温度为250C ±5°C，中空纤维膜孔径为0.1 μm，膜过滤压力为0.04?0.06MPa，膜过滤流速250?350L/ (h.m2)； (3)、往步骤(2)制得的浓缩菌液中注入新鲜灭菌的培养基，新鲜培养基的体积为步骤(I)中培养基体积的1/3?1/2，培养温度为37?42°C，pH6.2?6.4，培养至单位菌落数达到109cfu/mL以上； (4)、步骤(3)制得的菌液按照步骤(2)中空纤维膜过滤浓缩方法过滤浓缩2?3次，获得单位菌落数达到10ncfu/mL以上的浓缩菌液； (5)、往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为:1.5?2.5%明胶、2.5?3.5%蔗糖、1.5?2.5%乳清蛋白，为质量体积比；进行喷雾干燥，喷雾条件为:进风口温度为60?65°C，进样速度为17?18mL/min，制得微囊化乳酸菌发酵剂。
2.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中，对菌液浓缩之前，对中空纤维膜进行清洗杀菌，清洗杀菌的步骤为:酸洗、水洗至中性、碱洗、水洗至中性、酸洗、水洗至中性；具体为: (a)、使用柠檬酸配制的pH为I?3的酸清洗液循环酸洗2次； (b)、使用无菌水循环水洗至中性； (c)、使用碳酸钠配制的pH为10?12的碱清洗液循环碱洗2次； (d)、使用无菌水循环水洗至中性； (a)、使用柠檬酸配制的pH为I?3的酸清洗液循环酸洗2次； (b)、使用无菌水循环水洗至中性。
3.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的中空纤维膜为PVDF中空纤维膜。
4.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为:2 %明胶、3 %蔗糖、2 %乳清蛋白。
5.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的微囊化乳酸菌发酵剂中单位活菌数为I X 111?I X 10 12CfVmL,所述的微囊化乳酸菌发酵剂的体积粒径大小为5?60 μ m。
【专利摘要】本发明公开了一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，包括：乳酸菌接种到培养基上进行培养，菌液进行中空纤维膜过滤浓缩得到浓缩菌液，往浓缩菌液中注入新鲜的培养基再进行培养，制得的菌液中空纤维膜过滤浓缩2～3次，获得单位菌落数达到1011cfu/ml以上的浓缩菌液，往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，进行喷雾干燥，制得微囊化乳酸菌发酵剂。本发明将中空纤维膜与生物反应器组合，进行乳酸菌高密度培养和浓缩，实现在线连续过滤浓缩培养，避免了菌体转移带来的污染，然后偶联低温喷雾干燥，对已浓缩的高密度菌体进行有效保护，获得单位活菌数1×1011～1×1012cfu/ml乳酸菌发酵剂。
【IPC分类】C12N11-10, C12N11-02
【公开号】CN104711247
【申请号】CN201510105655
【发明人】周光宏, 梅林
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月10日