导入了二氧化碳固定循环的微生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及导入了二氧化碳固定循环的微生物、及使用了该微生物的物质生产方 法。
【背景技术】
[0002] 乙酰CoA是微生物代谢途径中的极其重要的中间体之一。可经由乙酰CoA而生产 多种代谢产物。作为可经由乙酰CoA生产的物质的例子，例如，已知有L 一谷氨酸、L 一谷氨 酰胺、L 一脯氨酸、L 一精氨酸、L 一亮氨酸、L 一异亮氨酸等氨基酸类；乙酸、丙酸、丁酸、己 酸、柠檬酸、3 -羟基丁酸、3 -羟基异丁酸、3 -氨基异丁酸、2 -羟基异丁酸、甲基丙烯酸、 聚一 3 -羟基丁酸等有机酸类；异丙醇、乙醇、丁醇等醇类；丙酮；聚谷氨酸；等等。
[0003] 乙酰CoA在多种微生物中是以葡萄糖等糖为碳源而生产的。糖经由被称为姆 登·迈耶霍夫途径（Embden - Meyerhof pathway)、恩特纳?杜多罗夫途径（Entner - Doudoroff pathway)、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway)等糖酵解系统的代谢 途径而被转化为丙酮酸，丙酮酸通过丙酮酸脱羧酶、丙酮酸一甲酸裂解酶等的作用而被转 化为乙酰CoA。此时，作为副产物产生二氧化碳（C0 2)、甲酸，因此，来自糖的碳并不全部作 为乙酰CoA而被固定。因此，为了将CO2再固定而增加乙酰CoA的产量，进行了一些研宄。
[0004] 已知一些在微生物的体内固定CO2而作为碳源的途径（Applied and Environmental Microbiology, 2011 ;77(6) :1925-1936)。具体而言，可举出卡尔文?本 森循环（Calvin - Benson cycle)、还原性 TCA 循环（reductive TCA cycle)、Wood - Ljungdahl 途径（Wood - Ljungdahl pathway)、3 -羟基丙酸循环（3 - hydroxypropionate cycle)、4 一羟基丁酸循环（4 一 hydroxybutyrate cycle)等。卡尔文?本森循环是存在 于植物、光养细菌中的包括约12种酶的0)2固定循环，通过核酮糖一 1，5 -双磷酸羧化酶 (RubisCO)固定CO2，最终生产甘油醛3-磷酸。还原性TCA循环是在以绿硫细菌（green sulfur bacteria)为代表的厌氧菌、微需氧菌中可见的循环，包括11种酶，特征在于具有 以铁氧还原蛋白（ferredoxin)为辅酶的CO 2固定酶（乙酰CoA羧化酶、2 -酮戊二酸合酶 (2 - oxoglutarate synthase))，通过与通常的TCA循环方向相反的反应，从〇}2生产丙酮 酸。Wood - Ljungdahl途径是在乙酸产生菌等厌氧性微生物中可见的途径，包括9种酶，通 过甲酸脱氢酶、CO脱氢酶等将CO2或辅酶上的甲酸还原，最终转化为乙酰CoAd-羟基丙酸 循环是在绿屈烧菌属（Chloroflexus)菌等中可见的循环，包括13种酶，通过乙酰CoA(丙 酰CoA)羧化酶的作用将CO 2固定，经由丙二酸单酰CoA等，生产乙酰CoA。4 一羟基丁酸循 环是存在于古细菌等中的途径，通过丙酮酸合酶、乙酰CoA(丙酰CoA)羧化酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶的反应而将CO 2固定，经由4 一羟基丁酰CoA等，生产乙酰CoA。
[0005] 已提出了将固定CO2的途径导入至生产有用化合物的微生物中、来生产有用物质 的方案。例如国际公开第2009/094485号及国际公开第2010/071697号中，公开了使用导 入了与乙酸菌的Wood - Ljungdahl途径类似的途径的微生物、由此从0)2生产乙酰CoA的 提案。另外，国际公开第2009/046929号中，公开了使用导入了氢化酶和四氢叶酸裂解酶的 微生物、由此从〇)2生产乳酸的提案。国际公开第2011/099006号中，提出了经由通向乙酰 CoA的二氧化碳固定反应、丙二酸单酰CoA的还原反应来固定CO2的循环的方案。德国专利 申请公开第102007059248号说明书中，提出了基于与4 一羟基丁酸循环类似的途径来生产 乙酰CoA的方案。
【发明内容】
[0006] [发明所要解决的课题]
[0007] 然而，从固定0)2而生产源自乙酰CoA的有用化合物这样的观点考虑，已知的二氧 化碳固定循环不能说效率一定高。例如，卡尔文?本森循环虽然作为自然界的二氧化碳固 定循环广为人知，但负责二氧化碳固定的RubisCO的反应速度慢，而且还可见氧化分解这 样的副反应，不能说是效率高的酶（Journal of Bioscience and Bioe ngineering, 2002 ; 94(6) :497-505)。Wood - Ljungdahl途径、国际公开第2009/094485号所公开的途径、国 际公开第2010/071697号所公开的途径、及国际公开第2009/046929号所公开的途径包括 将CO 2还原为CO或甲酸的途径，但催化这样强的还原反应的酶只在还原性的环境下起作用 的情况很多，难以在通常的条件下进行该还原反应，而且不容易将该酶导入到除绝对厌氧 性的微生物以外的微生物中。在还原的TCA循环中，通过丙酮酸合酶发生的还原反应、通过 2-酮戊二酸合酶发生的还原反应中，需要以铁氧还原蛋白作为电子受体的强还原力，反应 不易进行。另外，4 一羟基丁酸循环、3 -羟基丙酸循环、国际公开第2009/046929号所记 载的途径、及国际公开第2011/099006号所记载的途径中，利用琥珀酰CoA的还原或丙二酸 单酰CoA的还原这样的羧酸或其（硫代）酯的还原反应，但这样的反应作为酶反应通常是 困难的，认为对于发酵途径而言希望尽可能地避免这样的反应（Nature, 2008 ;451:86-89、 Nature Chemical Biolory, 2011 ;7:445_452)。4 一羟基丁酸循环经由 4 一羟基丁酰CoA 的 脱水或3 -羟基丙酸的脱水这样的脱水反应，但存在这样的反应在水中经常与逆反应（水 合）竞争这样的问题。在4 一羟基丁酸循环、3-羟基丙酸循环、还原的TCA循环中，在丙二 酸单酰CoA合成酶、丙酮酸合酶的作用下，生产出的乙酰CoA在循环内被转化为其他物质， 因而从生产乙酰CoA这样的观点考虑，不能说一定是有效率的。
[0008] 进而，当将上述的循环导入到微生物中而尝试生产某种物质时，必须要考虑构成 循环的酶的数目、应当新赋予的酶活性的数目。构成循环的酶、赋予的酶的数目越多，循环 的构建及控制就越难，而且对微生物的负担也增加。例如，在想要将Wood - Ljungdahl途 径导入到大肠杆菌时，需要导入至少9种基因，而认为，以能对这么多基因加以控制的方式 进行导入而构建物质生产途径，在现实中是极其困难的。显然，以少量的基因导入来构建由 少量的酶构成的循环，不仅在构建循环方面是有利的，而且在与微生物本来所具有的物质 生产途径组合方面也是有利的。
[0009] 因此，为了将CO2固定并转化为乙酰CoA，优选的是，1)构成循环的各酶的活性足 够高，2)不具有包含消耗乙酰CoA的酶的循环，3)新赋予的酶的数目少，循环简单。然而， 在迄今为止所报道的从〇) 2生产乙酰CoA的循环中，满足全部的1)~3)的条件的循环尚 不存在，均缺乏实际可行性。就其证据而言，从下述事实可见一斑：迄今为止，在可进行工业 利用的微生物中，实际上完全不存在如上述各文献的提案那样赋予酶活性而构建二氧化碳 固定循环、将CO 2转化为乙酰CoA、进而将乙酰Co转化为有用化合物的例子。
[0010] 本发明是基于上述情况而完成的。
[0011] 第一发明的课题在于提供一种对于利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA来说有用 的微生物。第一发明的课题还在于提供使用上述微生物高收率地制造乙酰CoA及源自乙酰 CoA的有用代谢产物的方法。
[0012] 第二发明的课题在于提供能经由乙酰CoA将二氧化碳高效地转化为有用的代谢 产物的、属于曲霉属（Aspergillus)或贪铜菌属（Cupriavidus)的微生物。第二发明的课 题还在于提供使用了上述微生物的有用的代谢产物的制造方法。
[0013] [用于解决课题的手段]
[0014] 解决上述课题的第一发明如下所述。
[0015] [Al]生产乙酰CoA的微生物，其具有乙酰CoA生产循环，所述生产乙酰CoA的微生 物是通过以下方式得到的：
[0016] 以不赋予下述（a)、（b)、（c)及（d)中的任一种，或即使赋予下述（a)、（b)、（c)及 (d)中的1种以上也不发挥其功能的方式，向不具有下述（a)、（b)、（c)、⑷及（e)的微生 物赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2 -羟基一 3 -氧代丙酸还 原酶及羟基丙酮酸还原酶组成的组中的至少1种的酶活性，
[0017] 并且，所述生产乙酰CoA的微生物中，选自丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂 解酶、乙醛酸醛连接酶、2 -羟基一 3 -氧代丙酸还原酶、羟基丙酮酸异构酶、羟基丙酮酸还 原酶、甘油酸2 -激酶、甘油酸3 -激酶、磷酸甘油酸变位酶及烯醇化酶组成的组中的至少 1种的酶活性被强化，和/或，选自苹果酸酶及富马酸还原酶组成的组中的至少1种的酶活 性被失活或降低，
[0018] 所述（a)、（b)、（c)、（d)及（e)分别为：
[0019] (a)具有从丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3 -羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固 定循环、（b)具有从乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环、（c)具有从巴 豆酰CoA和CO 2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环、 (d)具有从CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环、（e)选自苹果酸硫激酶及苹果酰CoA 裂解酶组成的组中的至少1种。
[0020] [A2]生产乙酰CoA的微生物，其具有乙酰CoA生产循环，所述微生物是通过以下方 式得到的：
[0021] 以不赋予下述（a)、（b)、（c)及（d)中的任一种，或即使赋予下述（a)、（b)、（c)及 (d)中的1种以上也不发挥其功能的方式，向不具有下述（a)、（b)、（c)、⑷及（e)的微生 物赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2 -羟基一 3 -氧代丙酸还 原酶及羟基丙酮酸还原酶组成的组中的至少1种的酶活性，
[0022] 所述生产乙酰CoA的微生物中，选自丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙 醛酸醛连接酶、2 -羟基一 3 -氧代丙酸还原酶、羟基丙酮酸异构酶、羟基丙酮酸还原酶、甘 油酸2 -激酶、甘油酸3 -激酶、磷酸甘油酸变位酶及烯醇化酶组成的组中的至少1种的酶 活性被强化，
[0023] 所述（a)、（b)、（c)、⑷及（e)分别为：
[0024] (a)具有从丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3 -羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固 定循环、（b)具有从乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环、（c)具有从巴 豆酰CoA和CO 2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环、 (d)具有从CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环、（e)选自苹果酸硫激酶及苹果酰CoA 裂解酶组成的组中的至少1种。
[0025] [A3] [Al]或[A2]所述的生产乙酰CoA的微生物，其被赋予了苹果酸硫激酶及苹果 酰CoA裂解酶的酶活性。
[0026] [A4] [Al]~[A3]中任一项所述的生产乙酰CoA的微生物，其中2 -羟基一3 -氧 代丙酸还原酶及甘油酸3 -激酶的酶活性被强化。
[0027] [A5] [Al]~[A4]中任一项所述的生产乙酰CoA的微生物，其具有以下的乙酰CoA 生产循环，所述乙酰CoA生产循环中：
[0028] 磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸被转化为草酰乙酸，草酰乙酸通过苹果酸硫激酶、苹 果酰CoA裂解酶及乙醛酸醛连接酶被转化为2 -羟基一 3 -氧代丙酸，2 -羟基一 3 -氧代 丙酸被转化为2 -磷酸甘油酸，2 -磷酸甘油酸被转化为磷酸烯醇式丙酮酸。
[0029] [A6] [Al]~[A5]中任一项所述的生产乙酰CoA的微生物，其具有包含下述（f)、 (g)、（h)、⑴、（j)、（k)、⑴及（m)的乙酰CoA生产循环：
[0030] (f)选自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶，和磷酸烯醇式丙酮酸羧化