用于控制蜂中的瓦螨的组合物的制作方法
【专利说明】用于控制蜂中的瓦螨的组合物
[0001] 发明领域和背景 本发明在其一些实施方案中涉及用于控制蜂中的瓦螨（Karroa mite)侵染的组合物。
[0002] 蜜蜂，即意大利蜜蜂（Apis mellifera)为农作物的有效授粉所必需，因此对世界 农业而言为关键性的。蜜蜂亦产生经济上重要的产物，包括蜂蜜和蜂蜡。蜜蜂易感染许多 寄生虫和病原体，包括外寄生螨、狄斯瓦螨（Varroa destructor)。
[0003] 蜜蜂的蜂群崩溃失调病（Colony Collapse Disorder，CO))对摧毁美国和世界农 业造成威胁。实际上，2006-2007年冬天在美国最近爆发的C⑶中，估计240万蜜蜂蜂巢的 25%或更多因为CXD而消失。估计23%的美国养蜂运作在2006-2007年冬天受C⑶所累，影 响了平均45%的养蜂人运作。在2007-2008年冬天，USDA-ARS的CXD行动小组估计，总计 来自商业运作的全部蜂巢的36%被CCD破坏。
[0004] C⑶通过自一群其成年蜂群体的迅速消失来表征，通常在距蜂群一定距离处发现 死亡的成年蜂。在崩溃末期，蜂王仅由少量新形成的成年蜂照料。崩溃的蜂群常常具有大 量封盖的幼蜂和食物储备。CCD现象首先在2006年报道；然而，养蜂人早在2004年就注意 到与CCD -致的独特的蜂群衰退。已假定多种因素作为原因，所述因素为例如螨和传染剂、 天气模式、电磁（蜂窝天线）辐射、杀虫剂、营养不良和应激。迄今为止，CCD的控制已集中 在瓦螨控制、环境卫生和移除受影响的蜂巢，针对机会性感染（例如小孢子虫属 进行处理和改善营养。至今仍未开发有效的预防措施。
[0005] 瓦螨寄生于蛹和成年蜂中并且在蛹的抚幼室中繁殖。螨使用它们的嘴刺穿外 骨骼并且以蜂的血淋巴为食。这些外骨骼中的伤口部位隐匿细菌感染，例如蜂房球菌 (Melissococcus pluton)，其导致欧洲幼虫腐臭病（European foulbrood)。此外，因为它们 的寄生作用，怀疑瓦螨充当许多蜜蜂病原体的载体，所述病原体包括羽翼畸形病毒（DWV)、 克什米尔蜜蜂病毒（KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒（ABPV)和黑蜂王台病毒（BQCV)，并且瓦螨可 减弱其宿主的免疫系统，使得它们易受感染的攻击。如果不加以治疗，瓦螨侵染典型地导致 群体水平的死亡率。
[0006] 治疗瓦螨侵染的现行方法被证明无效，因为螨形成对现有杀螨剂的抗性。此外，使 用这类杀螨剂可能将有害的化学品引入旨在用于人消费的蜂蜜中。
[0007] 美国专利申请20090118214教导了 dsRNA用于预防和治疗蜜蜂中的病毒感染中的 用途。
[0008] 发明概沐 根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种分离的核酸剂，所述核酸剂包含选 自SEQ ID NO. 93-105和106的核酸序列。
[0009] 根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种核酸构建体，所述核酸构建 体包含编码本文所公开的分离的核酸剂的核酸序列。
[0010] 根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种蜂可摄取的组合物，所述组 合物包含本文所公开的至少一种核酸剂。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染 的方法，所述方法包括向蜂巢的蜂给予有效量的至少一种核酸剂，所述核酸剂具有选自SEQ ID NO. 93-105和106的序列；从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病 (CCD)的易感性的方法，所述方法包括向蜜蜂给予有效量的至少一种核酸剂，所述核酸剂 选自如在SEQ ID No: 93-95和106中所述的核酸序列；从而降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病 (CCD)的易感性。
[0013] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物包含至少五种核酸剂，所述 核酸剂各自具有选自SEQ ID No: 93-105和106的不同的核酸序列。
[0014] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物包含至少一种具有如在SEQ ID No: 93、96、100、104和106中所述的核酸序列的核酸剂。
[0015] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物包含具有如在SEQ ID No: 93、96、100、104和106中所述的核酸序列的核酸剂的每一种。
[0016] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物的形式选自固体形式和液体 形式。
[0017] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物进一步包含蛋白质。
[0018] 根据本发明的一些实施方案，所述蛋白质呈花粉和/或大豆饼的形式。
[0019] 根据本发明的一些实施方案，所述液体形式选自蔗糖溶液和玉米糖浆溶液。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，所述蜜蜂为蜂群的蜂，且其中所述给予降低蜂群体 对蜂群崩溃失调病的易感性。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，所述给予通过饲喂来实现。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，所述核酸剂以蜂可摄取的组合物提供，所述蜂可摄 取的组合物选自液体的蜂可摄取的组合物和固体的蜂可摄取的组合物。
[0023] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物包含至少一种具有在SEQ ID No: 93、96、100、104和106中所述的核酸序列的核酸剂。
[0024] 根据本发明的一些实施方案，所述蜂可摄取的组合物包含至少五种核酸剂，每一 种核酸剂具有选自SEQ ID No: 93-106的不同的核酸序列。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，所述核酸剂作为核酸构建体给予。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，所述核酸剂如在SEQ ID No: 93、96、100、104和106 中所述。
[0027] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的相同的意义。虽然与本文所述方法和材料类似或等同的方法 和材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但方法和/或材料的实例描述于下文。如有 冲突，以本专利说明书（包括定义）为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的而 不意图其为必要限制。
[0028] 附图简沐 仅作为实例参考附图在此描述本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，强 调的是，所示细节是作为实例并且以说明性地论述本发明的实施方案为目的。在这点上，带 有附图的描述使得本发明的实施方案可如何实施对本领域技术人员显而易见。
[0029] 在附图中： 图1为用于dsRNA转移给瓦螨的各种实验的时程的示意图。
[0030] 图2A-E为狭线印迹分析（Slot blot analysis)已摄取的蜂（图2A)、通过成年蜂 喂养的幼虫（图2B)、蛹（图2C)和新形成蜂（图2D)中dsRNA-GFP存在情况的结果的照 片。dsRNA-GFP和来源于其的siRNA的存在情况通过RNA印迹来分析（图2E)。D=向蜂巢 给予dsRNA-GFP之后的天数。
[0031] 图3为阐述在顶行所示的天数（时间如图1所示）从瓦螨提取的RNA的RT-PCR 分析结果的照片。绿色数字（顶行）表示已将其放置在已摄取dsRNA-GFP的蜂上的瓦螨个 体，而黑色数字表示来自放置在对照蜂上的瓦螨的RNA。+ =阳性对照（携带GFP的质粒）。
[0032] 图4为阐述使用针对凋亡抑制剂蛋白（IAP ;序列27)的引物的瓦螨RNA的RT-PCR 的照片。M :大小标志物。泳道1-3 :来自用序列27的dsRNA处理的蜂巢的瓦螨的模板RNA。 泳道4 :来自对照蜂巢的瓦螨的模板RNA。泳道5 :阳性对照（携带IAP的质粒）。泳道6 : 阴性对照（无模板）。
[0033] 图5为阐述在对照蜂巢中以及在用dsRNA混合物I (最小）和用dsRNA混合物II (最大）处理的蜂巢中每只蜂（成年蜂加上封盖房内的幼虫）的瓦螨计数的条形图。
[0034] 图6为阐述dsRNA从成年蜂传递给瓦螨的照片。对来自用GFP-特异性dsRNA饲 喂的蜂和未处理的对照蜂的RNA (分别为泳道B+、B-)以及来自寄生于已处理的蜂或未处 理的对照蜂的瓦螨的RNA (分别为泳道V+和V-)进行RT-PCR。泳道C :阳性对照（含GFP 的质粒）。M=大小标志物； 图7为阐述dsRNA从蜂传递给瓦螨以及从瓦螨回传给蜂的照片。使用携带GFP dsRNA 或siRNA (V+)的瓦螨或者不含GFP-特异性dsRNA或siRNA的对照螨（V)侵染蜂。B+为 从使用给予GFP-dsRNA或siRNA的螨侵染的蜂扩增的RNA，B-为从使用不含GFP-特异性 dsRNA或siRNA的对照螨侵染的蜂扩增的RNA。泳道C :阳性对照（含GFP的质粒）。M=大 小标志物； 图8为瓦螨特异性dsRNA的60天饲喂试验的示意图，包括蜜蜂饲喂方案和对于瓦螨基 因表达的测试时间表（底部）以及给予瓦螨的蜜蜂的生命周期； 图9A-9F阐述了在瓦螨特异性dsRNA从蜂水平转移给瓦螨之后使瓦螨基因表达沉默。 图9A-9C为显示分别使用针对瓦螨基因 mRNA:RNA聚合酶III (9A，探针SEQ ID NO. 137和 138)、IAPl 和 IAP2 (9B，探针 SEQ ID NO. 141 和 142)和空泡质子 ATP 酶（9C，探针 SEQ ID NO. 139和140)的探针对瓦螨RNA进行的实时RT-PCR结果的平均值（土SE)的图表。所述 瓦螨RNA提取自饲喂5种瓦螨特异性dsRNA混合物（混合物I)的螨侵染的蜂，或者提取自 饲喂14种瓦螨特异性dsRNA混合物（混合物II)的螨侵染的蜂。对照代表提取自螨侵染 的未处理的蜂或者饲喂无关（GFP) dsRNA的螨侵染的蜂的瓦螨RNA。图9D-9F为显示瓦螨 RNA的半定量RT-PCR的照片，其阐述在以瓦螨特异性dsRNA为食的螨侵染的蜂中使瓦螨凋 亡抑制剂FAS基因表达特异性沉默。用提取自饲喂5种瓦螨特异性dsRNA混合物（9D，混合 物I)的螨侵染的蜂或者提取自饲喂14种瓦螨特异性dsRNA混合物（9D，混合物II)的螨侵 染的蜂的瓦螨RNA扩增（使用引物SEQ ID NO. 145和146)凋亡抑制剂FAS RNA。对照代 表用提取自螨侵染的未处理的蜂（9E，未处理的）或饲喂不相关dsRNA的螨侵染的蜂（9E， dsRNA-GFP)的瓦螨RNA扩增凋亡抑制剂FAS RNA。9F为显示扩增持家基因肌动蛋白（使用 引物SEQ ID NO. 147和148)的对照。数字表明扩增循环的数量。-RT反应用作DNA污染 的对照。注意在饲喂混合物I或混合物II的螨侵染的蜂中凋亡抑制剂FAS表达的强沉默 (图 9D); 图10为显示饲喂5种瓦螨特异性dsRNA混合物（混合物I)或14种瓦螨特异性dsRNA 混合物（混合物II)的蜂中或者饲喂无关（dsGFP) dsRNA的对照蜂或未处理的（未处理） 对照蜂中的平均（土SE)蜂总数（封盖幼蜂和成年蜂）。未检出显著差异； 图11为显示已处理的蜂和对照（如图10)中的瓦螨侵染（螨数量）的图表，表明在用 混合物I或混合物II饲喂蜂之后对瓦螨侵染的易感性上的显著降低。
[0035] 发明实施方案描沐 本发明在其一些实施方案中，涉及用于降低蜂对于瓦螨侵染的易感性的方法和组合 物。
[0036] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明不必在其应用 上限于以下描述中所述或通过实施例所例示的细节。本发明能够有其它实施方案或者以多 种方式实践或实施。
[0037] 蜂易感大量的病毒感染。通过减量调节特定的病毒基因产物来治疗这类感染已显 示在消除蜂中病毒诱导的感染方面成功（参见美国专利申请20090118214)。
[0038] 本发明人现提出通过减量调节特