一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，设及一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法。
【背景技术】
[0002] 酵母表面展示（Yeast surface display)是继瞻菌体展示技术发明之后，近些年 发展起来的一种新的蛋白表面展示技术。酵母细胞作为真核生物表达体系可W对真核蛋白 进行糖基化和二硫键异构化等修饰，并将其暴露展示在酵母细胞表面，因此酵母展示技术 被越来越多地应用在蛋白质/肤文库的构建与筛选、蛋白质相互作用、生物催化、抗体药物 筛选及口服疫苗的研制等诸多方面。
[0003] 酵母展示技术是一种新型的口服疫苗研制技术，和传统的疫苗相比利用酵母展示 技术制备的疫苗有W下优点：第一，酵母细胞表达的抗原能够更加有效的被生物体识别； 第二，酵母细胞本身颗粒度大，在进行口服免疫的过程中能够起到免疫佐剂的作用；第=， 酵母细胞作为真核表达系统，易于蛋白质的表达，可用于多种疾病的疫苗研究；第四，酵母 细胞培养容易，可实现高密度发酵生产疫苗的需求。虽然酵母表面展示技术在新型疫苗的 研制上有众多的优点，但是展示于酵母细胞表面的目的蛋白的展示量却不高，存在口服免 疫过程中抗原提呈量不足的问题，在一定程度上限制了其在疫苗研制方面的应用，因此如 何提高酵母细胞表面目的蛋白的展示量成为了急需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法。
[0005] 本发明所提供的在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法，具体可包括：
[0006] (1)将a凝集素的Aga2亚基的编码基因与目的蛋白的编码基因融合，得到融合基 因，记为融合基因1;在所述融合基因1中，所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因位于5' 端，所述目的蛋白的编码基因位于3'端；
[0007] (2)将所述融合基因1导入受体酵母细胞，所述受体酵母细胞能表达a凝集素的 Agal亚基，得到表达融合蛋白1的重组酵母细胞，所述融合蛋白1为由所述融合基因1编码 得到的蛋白质；所述融合蛋白1展示于所述重组酵母细胞表面；
[0008] 在所述重组酵母细胞中，既表达了所述a凝集素的Agal亚基，也表达了所述融合 蛋白1;所述融合蛋白1通过所述a凝集素的Agal亚基展示于所述重组酵母细胞表面（所 述融合蛋白1中的所述a凝集素的Aga2亚基通过二硫键与所述a凝集素的Agal亚基连接， 所述a凝集素的Agal亚基错定于所述重组酵母细胞的细胞壁）；
[0009] (3)制备外源表达的融合蛋白2;所述融合蛋白2由a凝集素的Aga2亚基和所述 目的蛋白融合而成；在所述融合蛋白2中，所述a凝集素的Aga2亚基位于N端，所述目的蛋 白位于C端；
[0010] (4)将所述融合蛋白2与所述重组酵母细胞反应，使所述融合蛋白2错定于所述重 组酵母细胞表面，从而实现在所述重组酵母细胞表面既展示所述融合蛋白1，又展示所述融 合蛋白2。
[0011] 在步骤（4)中，所述融合蛋白2之所W能够被错定于所述重组酵母细胞表面是因 为；通常情况下经过步骤（1)和（2)，所述重组酵母细胞表达的所述融合蛋白1的量较低， 使得所述重组酵母细胞表面展示的所述融合蛋白1的展示量低，导致所述重组酵母细胞表 面的一些所述a凝集素的Agal亚基的位点是空的，没有被所述融合蛋白1占据。
[0012] 在所述方法中，所述融合基因1既可W仅由所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因 和所述目的蛋白的编码基因首尾直接相连而成，也可W由所述a凝集素的Aga2亚基的编码 基因和所述目的蛋白的编码基因通过linker连接起来，当然与此同时还可W有标签序列 (如6X组氨酸的编码基因序列）等。所述融合蛋白2既可W仅由所述a凝集素的Aga2亚 基和所述目的蛋白首尾直接相连而成，也可W由所述a凝集素的Aga2亚基和所述目的蛋白 通过连接肤连接起来。
[0013] 在所述方法中，所述融合蛋白2既可为原核表达产物，也可为真核表达产物。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述融合蛋白2为原核表达产物，具体是按照包括如 下步骤的方法制备获得的；将所述融合蛋白2的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所 述融合蛋白2的重组大肠杆菌；裂解所述重组大肠杆菌，得到所述融合蛋白2。
[0015] 当所述融合蛋白2为原核表达产物时，还可包括对原核表达所得蛋白进行复性的 步骤。
[0016] 其中，将所述融合蛋白2的编码基因导入所述受体大肠杆菌中后，还包括采用 IPTG进行诱导的步骤。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Rosetta。所述融合蛋白2的编 码基因是通过重组表达载体的形式导入所述受体大肠杆菌的；所述重组表达载体具体为在 pET-2化载体的酶切位点化0 I和BamH I之间插入所述融合蛋白2的编码基因后得到的重 组质粒。
[0017] 在所述方法的步骤（2)中，所述融合基因1是通过重组表达载体的形式导入所述 受体酵母细胞中的；
[0018] 所述重组表达载体中表达所述融合基因1的表达盒由T7启动子、所述融合基因1 和MAT a终止子组成。
[0019] 具体的，所述重组表达载体为将所述目的蛋白的编码基因（去除了起始密码子和 终止密码子对应的脱氧核糖核巧酸）正向插入到酵母展示载体pYDl的多克隆位点（如化n I和EcoR I)处后得到的重组质粒。
[0020] 在本发明中，所述受体酵母细胞具体为酿酒酵母邸Y100。
[0021] 在所述方法的步骤（4)中，所述反应的条件具体为20-25°C揽拌反应4-化。
[0022] 其中，所述"揽拌"时的转速为2(K)巧m(所采用的转子长度为2cm)。
[0023] 在所述方法的步骤（4)中，所述反应的体系具体由所述重组酵母细胞悬液与所述 融合蛋白2混合而成；所述重组酵母细胞悬液的ODe。。为1. 0~2. 0,所述融合蛋白2在所述 体系中的浓度为0. 2~0. 3mg/ml (如0. 2mg/mL)。所述重组酵母细胞悬液为将所述重组酵 母细胞用含有Immol/L G甜、0. 2mmol/L GSSG、10% (体积分数）DMS0的PBS (抑8. 0)重悬 至ODe。。为1. 0~2. 0所得。
[0024] 在本发明中，所述目的蛋白具体为增强型绿色巧光蛋白巧GFP)。相应的，所述重 组表达载体具体为将序列表中序列2的第335-1050位所示的增强型绿色巧光蛋白的编码 基因（去除了起始密码子和终止密码子对应的脱氧核糖核巧酸）正向插入到酵母展示载体 pYDl的多克隆位点（如化n I和EcoR I)处后得到的重组质粒。所述融合蛋白2的氨基酸 序列具体为序列表中序列1，其编码基因的核巧酸序列具体为序列表中序列2。
[002引其中，序列1共由350个氨基酸组成，第1-70位为所述a凝集素的Aga2亚基的氨 基酸序列（由序列2的第1-210位编码得到）；第103-110位为Xpress epitope的氨基酸 序列（由序列2的第307-330位编码得到），第113-350位为增强型绿色巧光蛋白的氨基酸 序列（由序列2的第337-1050位编码得到）。
[0026] 本发明所提供的在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法在制备口服疫苗中的应用 也属于本发明的保护范围；所述口服疫苗的有效成分为利用所述在酵母细胞表面展示目的 蛋白的方法制备获得的展示有所述目的蛋白的重组酵母细胞。
[0027] 活性成分为利用所述在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法制备获得的展示有所 述目的蛋白的重组酵母细胞的口服疫苗也属于本发明的保护范围。
[0028] 本发明W酿酒酵母邸Y100为展示菌株，增强型绿色巧光蛋白巧GF巧为表面展示 蛋白，对酵母表面展示蛋白量进行检测。其中酿酒酵母作为面包业及酿酒业使用的发酵菌 种已经有数千年的历史，并且被美国抑A认定为安全性生物，不会对生物体产生毒副作用， 因此可W用于口服疫苗的研发中。并且为了弥补酵母细胞表面展示目的蛋白表达量不高的 问题，对EGFP蛋白与Aga2进行原核细胞融合表达，并将纯化后的蛋白人工错定到已经展示 EGFP蛋白的酵母细胞表面，W期达到提高酵母表面展示的EGFP蛋白的展示量。结果表明， 此种方法能够明显增加酵母细胞表面的目的蛋白展示量。该一结果解决了其在口服免疫过 程中抗原提呈量不足的问题，为新型口服疫苗的研制提供重要的理论基础与方法指导。
【附图说明】
[0029] 图1为酵母展示载体pYDl的质粒图谱。
[0030] 图2为利用引物pA、地对EGFP基因序列进行PCR扩增的结果。1 ;DL2000DNA marker ;2 水替代模板的阴性对照；3 ;EGFP基因扩增产物。
[0031] 图3为Kpn I和EcoR I双酶切鉴定pYDl-EGFP质粒。1 ;Kpn I和EcoR I双酶切 pYDl-EGFP ;2;未经酶切的 pYDl-EGFP ;3 ;DL2000DNA marker ;4 ;DL15000DNA marker。
[0032] 图4为利用pC和pD为上下游引物PCR扩增Aga2-EGFP基因序列。1 ;DL2000DNA marker ;2 ; W水替代模板的阴性对照；3 ;Aga2-EGFP基因扩增产物。
[0033] 图5为化0 I和BamH I双酶切鉴定祀T-27b-Aga2-EGFP质粒。1;未经酶切的 pET-2化-Aga2-EGFP ;2