一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其制备的预防猪胸膜肺炎产品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物和免疫学领域，特别是一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株及其 制备的预防猪胸膜肺炎产品
【背景技术】
[0002] 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种猪的呼吸道疾病，本病主要临床特征表现为出血性和 坏死性肺炎、纤维素性胸膜炎。通常认为，本菌通过呼吸道进入猪体内，然后直接通过气管 和支气管进入肺泡。除宿主和环境因素外，各种毒力因子是本菌致病性的主要因素，它们包 括荚膜、内毒素、外毒素、粘附素、转铁蛋白、外膜蛋白和分泌的酶类。
[0003] 胸膜肺炎放线杆菌是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原，它是一种革兰氏阴性短 杆菌，具有荚膜和菌毛，无运动性，不能形成芽孢。截止目前，根据APP表面可溶性抗原（主 要为荚膜多糖和脂多糖）的差异性，通过血清学方法将APP分为15个血清型，不同血清型 菌株毒力存在显著的差异。
[0004] APP毒力因子主要包括Apx毒素、尿素酶、外膜蛋白、荚膜和脂多糖等。研宄证实， Apx毒素既是APP最重要的毒力因子之一，同时又是主要的免疫原性蛋白，在APP免疫保护 方面发挥重要作用，根据溶血性和细胞毒性的差异将Apx毒素分成四种类型，分别为ΑρχΙ、 ApxII、ApxIII和ApxIVA，每种毒素的基因组成及生物学活性存在明显差异。研宄还显示， APP所有血清型菌株均可产生尿素酶，其活性有助于APP在猪呼吸道定殖感染，对APP的持 续性感染也有重要作用，UreC是尿素酶的C蛋白，研宄证实该蛋白在APP尿素酶活性中发 挥重要作用，该基因失活后脲酶活性消失，APP毒力下降了四倍。
[0005] 鉴于猪传染性胸膜肺炎在世界各地广泛流行和传播并造成较大的经济损失，采取 积极防制措施控制该病极为必要。虽然加强饲养管理和抗生素药物防治对控制该病具有重 要作用，但疫苗预防仍是控制该病的关键措施。目前APP全菌灭活疫苗是应用最广泛、最成 熟的一种防治猪传染性胸膜肺炎的疫苗，但该疫苗缺乏交叉保护活性，对不同血清型菌株 不能发挥保护作用。灭活疫苗和亚单位疫苗虽然可以降低患病猪的死亡率，但动物仍会出 现亚临床症状并进一步发展为慢性感染。而研宄发现野外感染任何一种血清型的康复猪可 抵抗不同血清型菌株的再次感染，因而提示应用APP活疫苗可提供较强的交叉免疫保护。 目前APP减毒活疫苗的研制仍处于实验室研制阶段，商品化的减毒活疫苗尚未出现。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。本 发明请求保护的技术方案如下：
[0007] 一种猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)减毒菌株 GS7CA，其保藏号为，CGMCC NO. 10016。
[0008] 所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株在制备预防猪胸膜肺炎的产品中的用途。
[0009] -种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分包含所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌 株。
[0010] 一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，其活性成分为所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株。
[0011] 所述疫苗还包括用于制备疫苗的常规辅助成分。
[0012] 一种经鼻腔接种的预防猪胸膜肺炎的活疫苗，是所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌 株的单菌落接种于TSB+NAD培养基中培养12~16h后，按培养物：TSB+NAD培养液为1 : 50 比例接种于TSB+NAD培养液中培养至0D600达到0. 8的产物。
[0013] 一种预防猪胸膜肺炎的方法，其特征在于，使用以所述猪胸膜肺炎放线杆菌减毒 菌株为活性成分的产品对猪进行免疫。
[0014] 胸膜肺炎放线杆菌（APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌，其中Apx 毒素和尿素酶（Urease)均是其主要的毒力因子，且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白。 为构建APP减毒突变菌株，本发明首先利用仅表达ApxII毒素蛋白且毒力较弱的APP血清 7型参考菌株（WF83)作为母源菌株，缺失apxIIC基因片段并插入具有免疫原性的apxIA-N 基因片段，利用sacB基因负向筛选系统构建无抗生素抗性基因标记的apXIIC7apxIA+单 突变菌株（GS7C);在单突变菌株GS7C的基础上进一步缺失基因组中ureC基因片段，并插 入具有免疫原性的apxIII-N基因片段，进而再利用sacB基因负向筛选系统构建成功表达 ApxIII-N蛋白的apxIIC7apxIA+、ureC7apxIIΓ双突变菌株（GS7CA)。该双突变菌株生物 学特性鉴定结果显示，双基因突变不影响细菌增殖能力，溶血活性和尿素酶活性完全丧失， 可表达ApxII蛋白及插入的外源基因 ApxIlI-N蛋白，连续传代基因组中插入的外源基因可 稳定遗传，对试验小鼠腹腔攻毒结果显示双突变菌株毒力较母源菌株降低9. 2倍，对断奶 仔猪攻毒试验显示双突变菌株对仔猪肺脏的损伤较母源菌株显著降低，对断奶仔猪的免疫 攻毒保护试验显示双突变菌株对APP不同血清型菌株的攻毒具有一定的交叉保护能力。
[0015] 本发明还提供一种预防猪胸膜肺炎的疫苗，所述疫苗的活性成分为上述猪胸膜肺 炎放线杆菌减毒菌株。本发明提供的疫苗具有下述优点：（1)具有交叉保护活性：本发明的 疫苗属于减毒活疫苗，对APP不同血清型菌株具有一定的交叉保护能力；（2)毒力低：所述 疫苗的活性成分猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，其毒力较母源菌株降低9. 2倍，对猪进行 免疫后不会引起发病或死亡，安全性高；(3)质量稳定：生产疫苗所使用的猪胸膜肺炎放线 杆菌减毒菌株，其具有免疫原性的外源基因 ApxIII-N可稳定遗传，能够保证每批疫苗的质 量；(4)生物安全性高：所述疫苗的活性成分猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，采用无抗性标 记基因 sacB基因负向筛选系统筛选而得，无生物安全风险，可用于疫苗的大量生产。
[0016] 在本发明的一些实施例中，所述疫苗的活性成分除了本发明的猪胸膜肺炎放线杆 菌减毒菌株外，还可以包含其它的本领域技术人员已知的具有猪胸膜肺炎免疫原性的成 分，与本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株一起发挥免疫作用，增强健康猪对APP不同 血清型菌株的抵抗能力。
[0017] 本发明还特别请求保护上述菌株制成的一种经鼻腔接种活疫苗，是所述猪胸膜 肺炎放线杆菌减毒菌株的单菌落接种于TSB+NAD培养基中培养12~16h后，按培养物： TSB+NAD培养液为1 : 50比例接种于TSB+NAD培养液中培养至0D600达到0. 8的产物。
[0018] 综上所述，本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，溶血活性和尿素酶活性 完全丧失，毒力大大降低，可稳定遗传。采用本发明的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株制成的 减毒活疫苗，毒力低，具有交叉保护活性，生物安全性高，质量稳定。
[0019] 本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌减毒菌株，已进行专利保藏，保藏信息如下：
[0020] 生物保藏信息：
[0021] 生物材料名称：GS7CA
[0022] 分类命名：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)
[0023] 保藏日期：2014年11月20日
[0024] 保藏号：CGMCC No. 10016.
[0025] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0026] 图1.经两次单交换构建突变菌株GS7C的PCR鉴定结果，其中M为Ikb plus Marker ;A : 1-10,第1次单交换突变菌株；B : 1-2, GS7C，3, APP7,4,第1次单交换突变菌株。
[0027] 图2.经两次单交换构建突变菌株GS7CA的PCR鉴定结果，其中M为Ikb plus Marker ;A :1-7,第1次单交换突变菌株；B :1，GS7CA，2, GS7C，C，阴性对照，P，阳性对照。
[0028] 图3.母源菌株和突变菌株在培养基中增殖能力的比较。
[0029] 图4.母源菌株与突变菌株溶血活性的比较，其中，中间垂直线为表皮葡萄球菌生 长线，生长线两侧为APP菌落。
[0030] 图5.细菌尿素酶活性检测结果。
[0031] 图6.母源菌株与突变菌株表达ApxII蛋白（A)和ApxIII蛋白⑶的Western blot检测。
[0032] 图7.突变菌株遗传稳定性的PCR检测结果，其中，M为Ikb plus Marker ;A :1_9， GS7C不同代次采样的检测结果，10, APP7 ;B :1-10, GS7CA不同代次采样的检测结果，11， APP7〇
【具体实施方式】
[0033] 以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要理解的是，下述实施例仅作为对本 发明的进一步说明，本发明的保护范围并不限于此。
[0034] 实验材料和试剂：
[0035] (1)菌株和质粒
[0036] APP血清1型参考菌株（4074)、血清2型参考菌株（S1536)、血清3型参考菌株 (S1421)和血清7型参考菌株（WF83)，由澳大利亚Pat Blackall博士惠赠，属于已知菌株， 记载在（I)Nielsen. R. · 1990. New diagnostic techniques:A review of the HAP group of bacteria. Can. J. Vet. Res. ,54:68-71·和（2)Blackall PJ，Klaasen HL，Bosc