一种普鲁兰酶产酶菌株及提高其产酶能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种普鲁兰酶产酶菌株、提高其产酶能 力的方法及所构建的新的高产普鲁兰酶工程菌株。
【背景技术】
[0002] 自然界和农业生产形成的糖质原料绝大多数是以多糖形式存在的，包括淀粉质原 料(玉米、小麦、薯类等)、木质纤维素(秸杆、林木等）和壳聚糖（昆虫、虾蟹外壳）等。由于种 种原因，目前能够被有效利用的主要是淀粉质原料。我国食品和发酵行业每年耗用玉米、大 米、小麦和薯类等淀粉质原料达5000余万吨。
[0003] 淀粉质原料用于食品与发酵生产时往往需要经过酶解生成葡萄糖。淀粉酶解所用 的酶有α -淀粉酶、糖化酶、普鲁兰酶、β -淀粉酶和异淀粉酶等。其中α -淀粉酶、糖化酶只 能水解淀粉中直链部分的α -1，4糖苷键，不能水解淀粉中支链淀粉分支点中的α -1，6-糖 苷键。异淀粉酶虽然能水解分支淀粉分支点的α-1，6糖苷键，但是不能水解由2~3个葡 萄糖残基构成的侧枝。普鲁兰酶不仅能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷 键，并能将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料。因此，在淀粉糖化阶段普鲁兰 酶与糖化酶一起使用，可大幅度提高液化后淀粉的水解速度，降低糖化酶用量，缩短糖化时 间，提高淀粉原料利用率，节能减排，减污增效，对提高食品和发酵工业生产技术水平和经 济社会效益具有非常重要的意义。
[0004] 现有技术中，我国普鲁兰酶市场被少数大型跨国公司所垄断，酶的价格昂贵，难以 满足国内食品与发酵等行业的迫切需要。尽管我国在普鲁兰酶产生菌资源筛选和分子改 造及基因工程等方面的研宄取得了一定的进展，但无论是从自然界筛选的菌株还是工程菌 株，均存在酶活力低、酶学性质差等问题，至今尚未实现工业化生产，因而尚需进一步探索 研宄。
【发明内容】
[0005] 本发明主要目的在于提供一种普鲁兰酶产酶菌株，同时提供了一种提高普鲁兰酶 产酶菌株产酶能力的方法，该方法通过将枯草芽孢杆菌Ρ43启动子转化进入普鲁兰酶产酶 原始菌株，即可实现普鲁兰酶酶活和相关基因表达量的大幅提高。
[0006] 本发明的技术方案如下。
[0007] -种鲁兰酶产酶菌株，该菌株名称为变栖克雷伯氏菌ΗΝ7, variicola HN7,已于2015年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO. 10357。
[0008] -种提高鲁兰酶产酶菌株产酶能力的方法，通过在菌株中转入枯草芽孢杆菌P43 启动子以提高其产酶能力，具体包括以下步骤： (1)提取DNA，将枯草芽孢杆菌进行扩增培养，然后离心收集菌体，按照Ezup柱式细菌 基因组DNA提取试剂盒的说明书提取所培养菌体的DNA ; (2) PCR扩增，PCR分别扩增四环素抗性基因 Tfei上游片段、四环素抗性基因 Tfei下游 片段、枯草芽孢杆菌P43启动子，具体如下： PCR扩增四环素抗性基因 Tfei上游片段时，引物序列设计如下： 上游片段的引物 Tet-Fl :5' -GGGGGATGATTGCGCCCCGGAAAGCAAAAATATCTAATTAAATTCTCA TGTTTGACAGCTTATCATCG-3'， 引物 Tet-Rl :5' -GCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAG ACAGTC-3' ； PCR扩增时，以pBR322质粒为模板，扩增产物记录为第一片段，4°C保存备用； PCR扩增四环素抗性基因 Tfei下游片段时，引物序列设计如下： 下游片段引物 Tet-F2 : 5' -CGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCAITTTCGGCGAGGACCGC TTTCGCTGGAG-3'， 引物 Tet-R2 :5' -CCTGCATGCACGTCGACACGAGATGCGCCGCGT-3' ； PCR扩增时，以pBR322质粒为模板，扩增产物记录为第二片段，4°C保存备用； PCR扩增枯草芽孢杆菌P43启动子时，引物序列设计如下： 上游引物为 PF3 :5' -ACGCGGCGCATCTCGTGTCGACGTGCATGCAGG-3'， 下游引物为 PR3 :5' -TCCAAGGTAATAGGGCATGACAGGTATATCTGAGCATCGATATAATGGTACCGCT ATCACTT-3' ； PCR扩增时，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，扩增产物记录为第三片段，4°C保存备 用； (3) PCR融合，将步骤（2)中分别扩增的序列片段采用融合PCR技术进行融合，具体顺序 为：第一轮PCR将第一片段与第二片段进行融合，第二轮PCR时加入第三片段，第三轮PCR 以步骤（2)中的Tet-Fl与pR3作为引物序列进行整体扩增； 切胶纯化后获得同源重组片段； (4) 电击转化，将步骤（3)纯化并验证序列正确的同源重组片段采用电击转化方式转化 普鲁兰酶产酶原始菌株，例如变栖克雷伯氏菌HN7 rariicoh HN7)，电击转 化液转移至新鲜的LB培养基，复苏后均匀的涂在含有四环素的抗性LB平板中培养过夜； (5) 转化子筛选鉴定，挑选步骤（4)中四环素抗性LB平板中阳性单克隆菌落，提取DNA， PCR鉴定，鉴定正确菌株即可用于普鲁兰酶发酵生产。
[0009] 采用上述方法所构建的高产普鲁兰酶工程菌，普鲁兰酶产酶原始菌株为变栖克雷 伯氏菌 HN7 (HN7 )。
[0010] 现有技术中，针对普鲁兰酶工程菌筛选工作，已有较多实践，例如克雷伯氏菌Z-13 rariico/a)(王明道等，一株产普鲁兰酶细菌的分离鉴定及其发酵条件优 化，信阳师范学院学报：自然科学版，2014, 27 (4) :569~573)，其原始产酶能力仅为5. 7 U/ mL，尚不能用于生产实践；而本发明所提供的变栖克雷伯氏菌HN7 HN7)，其原始产酶能力已可达7. 2 U/mL，进一步改进提高其产酶能力后即可用于生产实践。 [0011] 现有技术中，采用基因工程构建高产普鲁兰酶工程菌株时，一般通过质粒载体方 式将普鲁兰酶转化进入新的微生物表达系统，然后通过诱导表达、纯化等方式获得普鲁兰 酶，这种方法存在外源表达、提取、纯化操作复杂等弊端。而本发明通过基因工程技术将枯 草芽孢杆菌P43启动子转化进入产普鲁兰酶原始菌株，操作方式易于实现。由于普鲁兰酶 得以在本体内得到表达，合成和分泌途径没有发生改变，不会发生质粒丢失现象，因而遗传 稳定性高；而且本发明通过以变栖克雷伯氏菌HN7 (Z/e/wieBa rariicoh HN7)作为原 始出发菌株进行了具体验证，表明普鲁兰酶的酶活和酶表达量具有较好的提高，因而具有 较好的推广应用价值。
【附图说明】
[0012] 图1为初步筛选过程中所筛选出的变栖克雷伯氏菌HN7 (菌种鉴定后命名为变栖 克雷伯氏菌HN7,鉴定前仅标记为代号HN7)的培养图； 图2所筛选出的变栖克雷伯氏菌HN7 (菌种鉴定后命名为变栖克雷伯氏菌HN7,鉴定前 仅标记为代号HN7)的HN 7菌落形态（图A)及革兰氏染色图（图B); 图3为PCR扩增四环素抗性基因 Tfei的上、下游片段和枯草芽孢杆菌P43启动子片段 产物电泳图谱，其中1为四环素抗性基因 Tfei的上游片段；2为四环素抗性基因 Tfei的下游 片段；3为枯草芽孢杆菌P43启动子片段； 图4为PCR融合后同源重组片段，其中1为同源重组片段； 图5为同源重组片段转化克雷伯氏菌后重新PCR扩增出的同源重组片段的PCR电泳检 测结果； 图6为同源重组片段转化克雷伯氏菌后重新PCR扩增出同源重组片段部分序列及变栖 克雷伯氏菌上游基因组序列的PCR检测结果； 图7为同源重组片段转化克雷伯氏菌后重新PCR扩增出同源重组片段部分序列及变栖 克雷伯氏菌下游基因组序列的PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0013] 在介绍具体实施例前，首先对实施例中所用到的部分原料和试剂简要介绍说明如 下，未说明内容以现有技术中常用原料和试剂为准。
[0014] 菌株与质粒载体 本发明所构建的普鲁兰酶工程菌以变栖克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)为基础，该菌从淀粉生产厂附近土壤中筛选获得，目前已于2015年1月14日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)，保藏编号为：CGMCC NO. 10357。
[0015] 枯草芽孢杆菌1. 4255,来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0016] PBR322质粒，购自于宝生物工程（大连）有限公司。
[0017] 微生物培养所用培养基 变栖克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)保藏米用斜面保藏方式，斜面 保藏培养基（w/v)配方如下：糯米粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，KH2PO4 0.05%， MgSO4. 7H20 0· 01%，KH2PO4 0· 05%，琼脂 2. 0%，pH 6. 0。
[0018] 变栖克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicola HN7)及改造后菌株扩增采用种 子培养基进行扩增，种子培养基（w/v)配方如下：蛋白胨1. 0%，牛肉膏0. 3%，NaCl 0. 5%，pH 6. 0〇
[0019] 所构建的新的高产普鲁兰酶工程菌及对照菌株（即原始出发菌株）产酶采用产 酶培养基，产酶培养基（w/v)配方如下：糯米粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，KH2PO4 0. 05%，MgSO4 ? 7H20 0· 01%，pH 自然。
[0020] 筛选菌株时采用LB培养基，LB培养基（w/v)配方如下：胰蛋白胨1%，酵母提取物 0. 5 %，NaCl 1 % (固体培养基含1.5%琼脂粉)。
[0021] 部分试剂与酶 四环素、3, 5-二硝基水杨酸（DNS)、DNA凝胶回收试剂盒、Ezup柱式细菌基因组DNA提 取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司； 普鲁兰多糖为东京化成工业株式会社产品。