抑制肿瘤生长的重组间充质干细胞及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种抑制肿瘤生长的重组间充质干 细胞及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且 已从肌肉、骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs被认为是具有强大 的自我更新能力和多向分化潜能的非造血干细胞，在再生医学中具有极其重要的治疗学意 义。根据不同的用途可以特异性的将MSCs向不同的亚型转化，更精确的发挥MSC的功能。
[0003] TNF α 诱导蛋白 3 (tumor necrosis factor a induced protein 3, TNFAIP3, A20) 被认为是重要的抗炎和免疫调控蛋白。大多数细胞中A20都是低表达的，当NF- κ B被TNF α 等炎性因子活化后，会与Α20启动子区的NF-κ B受体结合，Α20会迅速被活化并且负调控 NF-κB、MAPK等通路，从而改变IFNγ、TNFα、IL-12、IL10、IL-15和IL-21在内的多种细 胞因子的表达水平。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抑制肿瘤生长的重组间充质干细胞及其制备方法与应 用。
[0005] 本发明提供的重组间充质干细胞，是降低受体间充质干细胞中Α20基因表达量 得到的重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述Α20基因 是TNFa诱导蛋白3。所述降低受体间充质干细胞中Α20基因表达量是通过向所述受体间 充质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中Α20基因表达的物质实现的。所述Α20基 因为编码序列表的序列3所示的蛋白质的基因。所述Α20基因为包括序列表的序列4自 5'末端第78-2516位核苷酸所不DNA分子的DNA分子。所述Α20基因具体可为序列表的 序列4所不的DNA分子或序列表的序列4自5'末端第78-2516位核苷酸所不的DNA分子。 所述抑制所述受体间充质干细胞中Α20基因表达的物质可为任何可以降低所述受体间充 质干细胞中Α20基因表达的shRNA、编码所述shRNA的DNA分子、表达所述shRNA的表达载 体、表达所述shRNA的重组微生物（如病毒）；抑制所述受体间充质干细胞中A20基因表达 的物质还可为降低所述受体间充质干细胞中A20基因表达的siRNA、编码所述siRNA的DNA 分子、表达所述siRNA的表达载体、表达所述SiRNA的重组微生物（如病毒）。所述抑制所 述受体间充质干细胞中A20基因表达的物质具体可为序列表的序列1所示的shRNA。所述 抑制所述受体间充质干细胞中A20基因表达的物质具体可为将序列1所示的shRNA的编码 DNA (将SEQ ID No. 1的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入慢病毒载体GVl 12的多克隆位 点（如Hpa I和Xho I位点间）得到的重组质粒。所述受体间充质干细胞为小鼠骨髓原代 MSCs或小鼠胚胎间充质干细胞系C3H/10T1/2。
[0006] 本发明还保护制备所述重组间充质干细胞的方法，包括如下步骤：降低受体间充 质干细胞中A20基因表达量，得到所述重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体 的间充质干细胞；所述A20基因是TNFa诱导蛋白3。所述降低受体间充质干细胞中A20基 因表达量是通过向所述受体间充质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中A20基因 表达的物质实现的。所述A20基因为编码序列表的序列3所不的蛋白质的基因。所述A20 基因为包括序列表的序列4自5'末端第78-2516位核苷酸所示DNA分子的DNA分子。所述 A20基因具体可为序列表的序列4所示的DNA分子或序列表的序列4自5'末端第78-2516 位核苷酸所示的DNA分子。所述抑制所述受体间充质干细胞中A20基因表达的物质可为 任何可以降低所述受体间充质干细胞中A20基因表达的shRNA、编码所述shRNA的DNA分 子、表达所述shRNA的表达载体、表达所述shRNA的重组微生物（如病毒）；抑制所述受体 间充质干细胞中A20基因表达的物质还可为降低所述受体间充质干细胞中A20基因表达的 siRNA、编码所述siRNA的DNA分子、表达所述siRNA的表达载体、表达所述siRNA的重组微 生物（如病毒）。所述抑制所述受体间充质干细胞中A20基因表达的物质为序列表的序列 1所示的shRNA。所述抑制所述受体间充质干细胞中A20基因表达的物质具体可为将序列 1所示的shRNA的编码DNA (将SEQ ID No. 1的核苷酸U替换为T的双链DNA)插入慢病毒 载体GV112的多克隆位点（如Hpa I和Xho I位点间）得到的重组质粒。所述受体间充质 干细胞为小鼠骨髓原代MSCs或小鼠胚胎间充质干细胞系C3H/10T1/2。
[0007] 本发明还保护所述重组间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为黑 色素瘤。具体可为B16-R)细胞引起的黑色素瘤。
[0008] 本发明还保护一种抗肿瘤药物，其活性成分为所述重组间充质干细胞。所述肿瘤 为黑色素瘤。具体可为B16-R)细胞引起的黑色素瘤。
[0009] 本发明还保护下述1)-10)中的任一种抑制受体间充质干细胞中A20基因表达的 生物材料：
[0010] 1)序列表的序列1所示的ShRNA ;
[0011] 2)表达1)所述的shRNA的表达载体；
[0012] 3)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞；
[0013] 4)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞；
[0014] 5)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞；
[0015] 6) 1)所述 shRNA 产生的 siRNA ;
[0016] 7)表达6)所述siRNA的表达载体；
[0017] 8)表达6)所述siRNA的重组微生物细胞；
[0018] 9)表达6)所述siRNA的重组动物细胞；
[0019] 10)表达6)所述siRNA的重组植物细胞。
[0020] 本发明对于肿瘤的治疗，特别是对于黑色素瘤的治疗具有重大价值。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1中，不同浓度的炎症细胞因子诱导MSCs中的A20基因表达一定时 间的结果。
[0022] 图2为实施例1中，固定浓度的炎症细胞因子诱导MSCs中的A20基因表达不同时 间的结果。
[0023] 图3为实施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的形态比较、A20基因 mRNA的表 达水平比较和免疫表型比较。
[0024] 图4为实施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的增殖特性与周期特性比较。
[0025] 图5为实施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的分化性能比较。
[0026] 图6为实施例4中，shA20减弱MSCs的免疫抑制作用。
[0027] 图7为实施例5中，shA20 MSCs对肿瘤的抑制作用。
[0028] 图8为实施例6中，机理分析的结果（实时定量PCR)。
[0029] 图9为实施例6中，机理分析的结果（western blot)。
【具体实施方式】
[0030] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0031] a -MEM 培养液：Gibco 公司，CAT. NO. 12000-022。DMEM-HG 培养液：Gibco 公司， CAT. NO. 10566-024。胎牛血清：上海依科赛生物制品有限公司，CAT. NO. FSP500。0.01M、 pH7. 2-7. 4的PBS缓冲液：Sigma公司。地塞米松、磷酸化维生素 C、β -磷酸甘油、II型胶原 酶、胰酶、油红0染液和碱性磷酸酶试剂盒均为Sigma公司产品。慢病毒载体GV112 :上海 吉凯基因化学技术有限公司。B16-R)细胞（小鼠黑色素瘤细胞）：中国医学科学院基础医 学研宄所基础医学细胞中心，货号为3111C0001CCC000215。
[0032] C57BL/6小鼠：购自军事医学科学院实验动物中心；在无特定病原体条件下饲养， 动物在年龄和性别上都相互匹配，并且所有的实验操作都符合军事医学科学院实验动物条 例。
[0033] 小鼠骨髓原代MSCs (即来源于C57BL/6小鼠的骨髓的原代MSCs)的分离和培 养按照下述文献中的方法进行：丫&叩，￥.1\1，1^，!1.，211&叩，1^，0&叩，1?.]\，1^，？.，听1叩，父· Υ. , Zhu, Η. , Guo, X. Μ. , Zhang, Y. , Liu, Y. L. , et al. (2013). [A new method for isolating and culturing mouse bone marrow mesenchymal stem cells]. Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi/Zhongguo bing Ii sheng Ii xue hui = Journal of experimental hematology/Chinese Association of Pathophysiology 21, 1563-1567。
[0034] 小鼠胚胎间充质干细胞系C3H/10T1/2 (简称C3H/10T1/2细胞）：ATCC，CCL-226?; 生长在含有4mM谷氨酰胺、lOOU/ml青霉素、lOOU/ml链霉素和10% (体积百分含量）胎牛 血清的α-ΜΕΜ培养液中，在5% C02、37°C条件下培养。
[0035] 采用FACS检测细胞的免疫表型，数据在FACS Aria II (BD)上收集并且用FlowJo 软件（TreeStar)分析。抗小鼠⑶45抗体、抗小鼠⑶105抗体、抗小鼠⑶44抗体、抗小鼠⑶29 抗体、抗小鼠 CDllb抗体、抗小鼠 CD31抗体和抗小鼠 Sca-I (Seal)抗体均属于BioLegend. BrdU 流式