耐盐耐蛋白酶的α-半乳糖苷酶AgaAHJ8及其基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐盐耐蛋白酶的α -半乳糖苷酶 AgaAHJ8及其基因。
【背景技术】
[0002] 具有α -半乳糖苷的低聚糖和多聚糖广泛存在于食品和饲料原料中，尤以豆科类 植物种子含量最高（Karr-Lilienthal et al·，Livest Prod Sci, 2005, 97:1 - 12·)，如密二 糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖和角豆胶、瓜尔胶等半乳甘露聚糖。α -半乳糖苷 酶（a-galactosidase，EC 3. 2. 1.22)又叫密二糖酶（melibiase)，可催化水解这些低聚糖 和多聚糖底物中的α-半乳糖苷键，进而应用于饲料、食品、造纸和医疗等行业中（Zhou et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2010, 88:1297 - 1309)〇
[0003] 耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及 其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌 等所消耗的能源（Zhou et al. Folia Microbiol, 2014, 59:423 - 431);由于内源蛋白酶广 泛存在于生物体中且外源蛋白酶常作为一种添加剂，所以耐蛋白酶的酶可应用于食品等多 种行业（Zhou et al. Folia Microbiol, 2014, 59:423 - 431)。例如，高盐稀态工艺生产的酱 油品质高，风味佳，酱醅或酱醪中的氯化钠浓度达18% (w/v)，制作酱油的原料中具有内源 蛋白酶，发酵时可加入外源的蛋白酶及半乳糖苷酶，但由于酶活性在高浓度氯化钠条件下 受到抑制，导致高盐稀态酱油发酵存在发酵周期长、设备利用率低、原料利用率和氨基态氮 出品率较低等不足之处（专利：201110248389. 8)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种耐盐耐蛋白酶的α -半乳糖苷酶AgaAHJ8。
[0005] 本发明的再一目的是提供编码上述α -半乳糖苷酶的基因。
[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008] 本发明所述α -半乳糖苷酶AgaAHJ8可得自海洋杆菌（Pontibacter sp.)。 AgaAHJ8的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明的α -半乳糖苷酶AgaAHJ8总共含402个氨基酸，理论分子量为45. 2kDa， 其中N端19个氨基酸为预测信号肽序列"MKKLFLFFFLNLYIGAAYA"，成熟的α -半乳糖苷酶 AgaAHJ8含383个氨基酸。该酶的最适pH值为5. 5,在ρΗ4. 0 - 8. 0的范围内维持72%以上 的酶活性；经ΡΗ4. 0 - 8. 0缓冲液在37°C下处理lh，该酶酶活剩余达73%以上。该酶最适温 度50°C，在37°C下稳定，在50°C时半衰期小于5min。在pH5. 5及50°C下，该酶对2mM pNPG (p-nitrophenyl-α -D-galactopyranoside)的比活为43. 5±1· OUmg-1，对0· 5% (w/v)的密 二糖（melibiose)、棉籽糖（raffinose)和瓜尔胶（guar gum)的比活分别为 0·47±0·07、 1. 93 ±0. 07和0. 46 ±0. 06U mg'该酶具有良好的耐盐性，在反应体系中加入3. 5 - 30. 0% (w/v)的NaCl，仍然具有70 %以上的酶活。该酶也具有良好的蛋白酶抗性，经胰蛋白酶和蛋 白酶K在37°C下处理lh，该酶仍能分别保持101. 1 %和108. 9%的酶活。
[0010] 本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因 agaAHJ8,该基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本发明通过基因组测序的方法克隆了 α-半乳糖苷酶AgaAHJS的编码基因 agaAHJ8,其全长1209bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。经BLAST比对，该α -半乳糖 昔酶 AgaAHJ8 全序列与 GenBank 中 Pedobacter sp.V48 来源的假定蛋白（hypothetical protein)N824_24065(ETZ22001)全序列具有最高的氨基酸序列一致性，为69. 2%，该 Pedobacter sp. V48来源的蛋白活性还未研宄；AgaAHJ8全序列与确证活性的Cellvibrio japonicus Uedal07来源α -半乳糖苷酶（B3PGJ1)全序列的一致性为44. 5%。说明α -半 乳糖苷酶AgaAHJ8是一种新的α -半乳糖苷酶。
[0012] 本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因 agaAHJS的重组载体，优选为 pEasy-E2-agaAHJ8。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序 列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半 乳糖苷酶基因和表达载体pEasy_E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒 pEasy_E2_agaAHJ8 〇
[0013] 本发明还提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因 agaAHJS的重组菌株，优选所述菌 株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/agaAHJ8。
[0014] 本发明制备α -半乳糖苷酶AgaAHJS的方法按以下步骤进行：
[0015] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0016] 2)培养重组菌株，诱导重组α -半乳糖苷酶表达；
[0017] 3)回收并纯化所表达的α -半乳糖苷酶AgaAHJ8。
[0018] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /agaAHJ8。
[0019] 本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适 ΡΗ5. 5,最适温度，50°C，可水解密二糖、棉籽糖及瓜尔胶，具有良好的耐盐和耐蛋白酶特性。 该酶可应用于尚盐食品和海广品加工领域。
【附图说明】
[0020] 图1 :在大肠杆菌中表达的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8的SDS-PAGE分析，其中， M :蛋白质Marker ;1 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8 ;
[0021 ] 图2 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8的pH活性；
[0022] 图3 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8的pH稳定性；
[0023] 图4 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8的热活性；
[0024] 图5 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8的热稳定性；
[0025] 图6 :纯化的重组α -半乳糖苷酶AgaAHJ8在不同浓度NaCl中的活性。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027] 试验材料和试剂
[0028] 1、菌株及载体：海洋杆菌（Pontibacter sp.)同文献报道菌种性质，如中国工业 微生物菌种保藏管理中心菌株Pontibacter sp. CICC 23788;大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司。
[0029] 2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶及dNTP购自TaKaRa公司； pNP(p-nitrophenol)、pNPG(p-nitrophenyl_a -D-galactopyranoside)、半乳糖和密二糖 (melibiose)购自Sigma公司；棉籽糖（raffinose)购自美国Amresco公司；其它都为国产 试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0030] 3、培养基：
[0031] LB 培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 1000ml，pH 自 然（约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。
[0032] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0033] 实施例1 : α -半乳糖苷酶基因 agaAHJ8的克隆
[0034] 提取海洋杆菌基因组DNA :将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶， 37°C处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，500mM NaCl，2% (w/ ￥)505卬!18.0,70°0水浴裂解6〇111丨11，每隔1〇111丨11混匀一次，在4°0下10000印111离心5111丨11。取 上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C 下1000 Orpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗绦两次，真空干燥，加入适量TE溶 解，置于-2〇°C备用。
[0035] 用超声打断仪Biorupter将5 μ g的海洋杆菌基因组打断为400 - 600bp的片 段，用Genomic DNA Clean&Concentratio