与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及分子标记，特别是涉及2个与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]辣椒疫病是由辣椒疫霉菌Mora capsici Leon.)引起的一种毁灭性土传病害(Leonian，1922)，在世界范围内广泛传播。广东地区由于高温高湿气候条件的影响，辣椒疫病尤为严重，辣椒生产经常损失惨重。
[0003]辣椒疫病根据病原菌侵染部位的不同表现为根腐、果腐、茎枯和叶枯等不同病症(Ristaino, 1990)，并且多项研宄结果认为，根腐、果腐、茎枯和叶枯疫病抗性的遗传机理并不相同(Barksdale et al., 1984; Sy et al., 2005)。辣椒根腐疫病的发生通常直接导致植株不可逆死亡，对辣椒生产的损害最为严重，国内外学者研宄结果表明根腐疫病的抗性遗传机制从广义上可分为2种类型，分别为数量抗性和特异抗性。数量抗性表现为多基因控制，目前多项研宄结果鉴定并定位的主效根腐疫病抗性基因位于辣椒第5号染色体上(Quirin et al., 2005; Truong et al., 2013);特异抗性为单基因控制，表现为对某种特异菌株具有完全抗性(Monroy-Barbosa and Bosland, 2008)，目前为止，国内外还未见根腐疫病特异抗性基因定位的报道。
[0004]CM334是国际公认的抗性水平最高的抗辣椒疫病材料，已在辣椒抗病研宄和育种中广泛应用。对基因(QTL)的鉴定及定位是利用分子标记辅助选择育种的前提。目前，只有辣椒第5号染色体上的主效抗性QTL位点紧密连锁标记开发比较成熟，并能应用于育种实践中。由于辣椒疫病病症表现多样，辣椒疫霉菌又存在生理小种分化，要培育一个对所有疫霉菌都具有抗性的辣椒品种几乎不可能，而考虑到其特异抗性的特点，针对当地优势疫霉菌株鉴定抗性基因位点并开发紧密连锁分子标记，有助于加快抗性品种的选育进程。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的在于提供2个与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子不己O
[0006]本发明的另一个目的在于提供用于扩增与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对。
[0007]本发明的另一个目的在于提供所述与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的应用。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记，定位于辣椒第10号染色体上，分别位于辣椒根腐疫病特异抗性基因两侧，命名为P52-11-21和P52-11-41。
[0009]所述分子标记P52-11-21包含SEQ ID N0.1所示核苷酸序列；所述分子标记P52-11-41包含SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
[0010]用于扩增上述与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对。
[0011]用于扩增分子标记P52-11-21的引物序列如下所示:
Fl:5’ -CAATCCAAACAAGTCCTAAG-3，(SEQ ID N0.3)；
Rl:5’ -GGTGCAATTGAAAATCTAAG-3? (SEQ ID N0.4)；
用于扩增分子标记P52-11-41的引物序列如下所示:
F2:5’ -TTGATGAGATGGGAAGTAAA-3，(SEQ ID N0.5)；
R2:5’ -CACCAACAATAATAGAACTACA-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0012]分子标记P52-11-21和P52_ll_41在辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种或者辣椒根腐疫病特异抗性基因定位中的应用。
[0013]一种辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种的方法，该方法包括:以CM334或其衍生品种为对象，用特异性引物PCR扩增待检测植株DNA，如果扩增产物中存在所述分子标记P52-11-21和/或分子标记P52-11-41，则表示该植株中存在辣椒根腐疫病特异抗性基因。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明提供了与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记P52-11-21与P52-11-41，所述分子标记与根腐疫病特异抗性基因紧密连锁，遗传距离分别为1.5cM和1.lcM，可直接用于辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于辣椒育种实践中，同时为克隆辣椒根腐疫病特异抗性基因及其功能研宄奠定了良好的基础。
【附图说明】
[0015]1、图1为抗性基因关联区域:横坐标表示染色体位置，纵坐标表示Δ (SNPjndex)的值；红线表示所有Δ (SNPjndex)拟合后的结果；蓝色虚线标记Δ (SNPjndex)的阈值，拟合后的△ (SNP_index)越强，表不关联性越强；
2、图2为标记P52-11-21的PCR扩增结果七、匕分别为抗病亲本CM334和感病亲本10399的扩增带型，主带分别为长127bp和139bp B s分别为抗病混池和感病混池的扩增带型AC1F1群体随机扩增表示在BC ^群体中随机挑选的10株抗病或感病单株的PCR扩增结果，扩增出长139bp主带的为感病单株，同时扩增出127bp和139bp主带的为杂合抗病单株；
3、图3为标记P52-11-41的PCR扩增结果七、匕分别为抗病亲本CM334和感病亲本10399的扩增带型，主带分别为长147bp和141bp B s分别为抗病混池和感病混池的扩增带型AC1F1群体随机扩增表示在BC ^群体中随机挑选的10株抗病或感病单株的PCR扩增结果，扩增出长141bp主带的为感病单株，同时扩增出147bp和141bp主带的为杂合抗病单株；
4、图4为抗性基因的遗传连锁图谱:左边数值代表遗传距离(单位:cM)，右边标示SSR分子标记，均位于辣椒第10号染色体，根腐疫病抗性基因定位于标记P52-11-21和P52-11-41 之间。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0017]以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]—、遗传群体的构建及遗传分析 1、供试材料
植物材料:国际公认辣椒抗疫病材料CM334和高世代纯合感病材料10399，均由美国新墨西哥州立大学辣椒遗传育种专家Paul ff.Bosland教授赠予。CM334和10399杂交(正反交)获得F1, F1自交得F 2，回交得BC1F1，用作遗传分析和定位群体。
[0019]菌种材料:辣椒疫霉菌株Byl4，从广州钟落潭实验基地发病辣椒植株上分离获得，分离方法参照李智军等(2007)。接种前按郑小波等(1990)叙述的方法配制游动孢子接种液。
[0020]2、表型鉴定
待鉴定材料种植于55mmX 55mmX 70mm穴孔中，于无疫霉菌污染的温室中正常管理生长至4-6片真叶时转移到人工气候箱，于接种前12小时浇透水。采用灌根法接种，接种浓度为14个游动孢子/ml，于距植株根际I?2cm处用注射器小心注入5ml游动孢子的悬浮液，黑暗保湿24小时后正常管理。接种后待感病对照10399开始发病时进行调查，此后每天调查一次，待感病对照全部发病萎焉时(接种后约10天)停止调查。表型评价参照Monroy-Barbosa and Bosland (2008)，没有出现病症的植株为抗病株，出现病症的植株为感病株。
[0021]3、遗传分析