甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋 白和应用。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是一种细胞外的结构蛋白，主要存在于人和动物的肌腱、韧带、软骨、皮 肤及结缔组织中。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，其水解得 到的多肽产物不仅有许多重要的生理活性功能而且具有良好的消化吸收特性。这使得胶原 蛋白在近年来成为研宄热点，同时也在医药、食品、美容以及生物材料等方面得到了广泛的 应用。
[0003] 传统的制备胶原蛋白的主要方法为从牛、猪等动物的皮肤、胎盘等组织提取，具有 诸多不利因素。例如：利用酸碱水解法从动物结缔组织中提取的胶原蛋白掺杂了较多的杂 质，在提取过程中部分蛋白较易丧失活性；异体来源的胶原蛋白存在着传染病危险（疯牛 病等）、异种或异体的排斥反应、刚性很强易引发分子链断裂、提取物不溶于水导致细胞毒 性等问题。利用基因工程法生产胶原蛋白不仅可以克服传统方法中存在的病毒隐患等问 题，同时也使胶原蛋白的免疫排异性和亲水性等性能得到极大的改善。大肠杆菌（E. coli) 是最常用的外源基因表达系统之一，因生长周期短、培养成本低廉、代谢调控较为成熟，在 重组蛋白质生产过程中占主导地位。利用大肠杆菌合成的胶原分子具有显著的柔韧性，可 以更广泛的将稀有氨基酸残基合成到重组蛋白中。
[0004] 甲鱼（Trionyx sinensis Wiegmann)是重要的淡水爬行动物，在亚洲的很多国家 和地区都有养殖，如中国、日本、韩国、越南和台湾。自古以来，甲鱼就以其美味和营养而深 受中国人民的喜爱。鳖甲周围的结缔软组织通常被称为"裙边"，裙边胶原蛋白含量相当丰 富，可作为高品质、优良胶原蛋白的来源。迄今为止，尚无甲鱼胶原蛋白基因及其重组蛋白 的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段，该甲 鱼胶原蛋白基因功能片段编码的重组蛋白具有强抗氧化性；
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段编 码的强抗氧化性的重组蛋白，该重组蛋白即为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段；
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种上述重组甲鱼胶原蛋白功能肽 段的制备方法；
[0008] 本发明所要解决的还有一个技术问题在于为上述重组甲鱼胶原蛋白功能肽段提 供一种应用。
[0009] 解决上述技术问题采用的技术方案是：
[0010] 一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段，该甲鱼胶原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，该重组甲鱼胶原 蛋白功能肽段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，其含有252个氨基酸，含有27个 胶原蛋白特有的Gly-X-Y重复域。
[0012] 重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备方法，步骤如下：
[0013] 1、甲鱼胶原蛋白基因功能片段的克隆
[0014] 用Trizol LS (购自于Invitrogen公司）从新鲜的甲鱼组织中提取总RNA，提取步 骤根据Invitrogen公司提供的说明书进行；以总RNA为模板，反转录得甲鱼cDNA ;设计甲 鱼胶原蛋白基因功能片段引物，甲鱼胶原蛋白基因功能片段引物序列为：
[0015] F 5' -CATATGATCAACGCAGAGTGGCCATTATG-3' (划线处为 NdeI 酶切位点）
[0016] R 5' -CTCGAGAGCATACTTGTGTTGCACGCGA-3' (划线处为 XhoI 酶切位点）
[0017] 以上述甲鱼cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，回收特异性DNA扩增条带，将 回收产物连接载体PMD19-T(购自于大连宝生物工程有限公司），转化E. coli DH5a感受 态细胞（购自于大连宝生物工程有限公司），涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种 于5mL LB液体培养基（1升培养基含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH7. 5) 中，37°C，200rpm振荡过夜培养，提取重组质粒。对该重组质粒进行测序，得甲鱼胶原蛋白基 因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 2、大肠杆菌重组表达载体的构建
[0019] 将上述重组质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I (购自于大连宝生生物工程有限 公司）双酶切后，回收甲鱼胶原蛋白功能片段连接表达载体pET-28a，连接后转化E. coli DH5 α感受态细胞，涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基（1升培养基含有胰化蛋 白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，pH7. 5)，挑选阳性克隆接种于5mLLB培养基 中37°C，200rpm培养过夜，提取质粒备用。
[0020] 3、基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段大肠杆菌Rosetta基因工程菌的构建
[0021] 将上述提取得到的质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，涂布含有34 μ g/mL氯 霉素和50 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基，待其长出阳性克隆即为基因重组甲鱼胶原蛋 白功能片段大肠杆菌Rosetta基因工程菌。
[0022] 4、制备基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段
[0023] 挑取上述阳性克隆接种于5mL LB培养基中37°C，200rpm培养过夜。取过夜培养 的菌液按菌液：LB培养基为1 : 100的比例接种于新鲜的LB培养基中，37°C，200rpm培养 至OD6c?的值为0. 6-0. 8,加入终浓度为lmmol/L的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱 导表达。继续培养4h后，4°C，5000rpm离心10min收集菌体，菌体用与原始菌液体积相同 的 PBS(1L 溶液中含有 NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KH2PO4O. 2g，ρΗ7· 4)重悬 后4°C，5000rpm离心10min收集沉淀以洗绦菌体，重复上述洗绦步骤一次。将最后得到的 菌体按每克湿菌体加入5mL PBS重悬，超声波破碎细胞，破碎条件为：300W，破2s，停8s，120 个循环。
[0024] 将上述破碎后的菌液4°C，12, OOOg离心20min收集包涵体，包涵体用40mL PBS重 悬后4°C，12, OOOg离心20min以洗绦沉淀，重复上述洗绦步骤两次，最后得到的包涵体用 5-1〇!1^的尿素缓冲液（该缓冲液含有2〇11111^8-!1(：1、81尿素、50〇1111恥(：1，51111咪唑，？!1调 至8. O再加入ImM β -疏基乙醇）溶解，溶解后的包涵体蛋白用His GraviTrap螯合柱（购 自于GE公司）层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。将 纯化得到的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段透析复性，冷冻干燥至粉末状即得重组甲鱼胶原蛋 白功能肽段。该重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的分子量为38kDa，含有27个胶原蛋白特有的 Gly-X-Y重复域，与GenBank中的蛋白序列比对显示本发明的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段 与细粒棘球绦虫XI型胶原蛋白α 2链具有最高的同源性（47% )。
[0025] 重组甲鱼胶原蛋白功能肽段抗氧化活性的检测。其检测方法如下：
[0026] 采用芬顿反应体系。具体操作为：取一空白组试管依次加入0. 025mol/L的 磷酸缓冲液（IOOmL 溶液中含有 Na2HPO4 · 12Η200· 716g、KH2PO40.0 68g，pH7. 4) lmL， 40 μ g/mL的番红花红lmL，蒸馏水0· 5mL，3wt %过氧化氢ImL (新鲜配制），0· 945mmol/ LEDTA-Fe2+Iml (I. 89mmol/L 的 EDTA 与 I. 89mmol/L 的 FeSO4等体积混合，新鲜配制）；另取 一对照组试管依次加入0. 〇25mol/L的磷酸缓冲液lmL，40 μ g/mL的番红花红lmL，蒸馏水 I. 5mL，3wt%过氧化氢lmL。试验组按顺序依次加入0· 025mol/L的磷酸缓冲液lmL，40 μ g/ mL的番红花红lmL，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0. 5mL，3wt%过氧化氢lmL，0. 945mmol/ LEDTA-Fe2+lml。将上述试管混合均匀后置于37°C水浴中反应30min，测A52tlmi值，按下式计 算重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的羟自由基清除率：
[0027] 清除率％ = (A样品-A空白）/ (A对照-A空白）X 100%
[0028] 式中，A样品、A空白、A5iffi分别为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段、空白组和对照组的吸光 值。
[0029] 取羟自由基特异性清除剂D-甘露醇代替重组甲鱼胶原蛋白功能肽段做相同试 验。
[0030] 经检测，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段具有优异的抗氧化活性。当浓度为lmg/mL、 I. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL和3mg/mL时，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的轻自由基清除率 分别为27. 4%、43. 2%、63. 2%、83. 2%和98. 9%，高于同等测定条件下的D-甘露醇的羟自 由基清除率，高于刺参体壁胶原蛋白[毕琳·刺参（Stichopus japonicus)体壁胶原蛋白 的理化性质和生物活性研宄[D].青岛：中国海洋大学，2006.]、尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白 [Zeng MY，Guo Y，Liu ZY，Dong SY，Zhao YH，Cui