包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质，和用于产生提取的植物脂质 的方法。
【背景技术】
[0002] ω-3长链多元不饱和脂肪酸（LC-PUFA)现在被广泛公认为是用于人和动物健康 的重要化合物。这些脂肪酸可从膳食来源中获得或者可通过转化亚油酸（LA，18 :2ω6)或 α-亚麻酸（ALA，18 :3ω 3)脂肪酸来获得，这两种脂肪酸均被认为是人膳食中的必需脂肪 酸。虽然人和很多其它脊椎动物能够将从植物来源获得的LA或ALA转化为C22,但他们以 极低的速率进行此转化。此外，最现代的社会具有不平衡的膳食，其中至少90%多元不饱 和脂肪酸（PUFA)为ω6脂肪酸，而不是被认为理想的4 : 1比率或更少的ω6 :ω3脂肪 酸（Trautwein，2001)。人的LC-PUFA如二十碳五烯酸（ΕΡΑ，20 :5ω3)和二十二碳六烯酸 φΗΑ，22:6ω3)的直接膳食来源大部分来自鱼或鱼油。因此，健康专业人员推荐在人膳食 中常规地包括含有显著水平的LC-PUFA的鱼。逐渐地，鱼来源的LC-PUFA油并入例如食物 产品和婴儿配方中。然而，由于全球和国家渔业的下降，需要这些有利的增强健康的油的替 代来源。
[0003] 与动物相反，显花植物缺乏合成具有长于18个碳的链长度的多元不饱和脂肪酸 的能力。具体地说，农作物和园艺植物连同其它被子植物不具有合成源于ALA的较长链ω3 脂肪酸如ΕΡΑ、二十二碳五烯酸（DPA，22 :5ω 3)和DHA所需要的酶。因此，植物生物技术中 的重要目标为对产生大量LC-PUFA的农作物植物进行工程化，从而提供这些化合物的替 代来源。
[0004] LC-PUFA牛物合成路径
[0005] LC-PUFA在有机体如微藻、苔藓和真菌中的生物合成通常作为一系列氧依赖性去 饱和和延伸反应（图1)出现。在这些有机体中产生EPA的最常见路径包括Λ 6-去饱和、 Λ 6-延伸和Λ 5-去饱和（称为Λ 6-去饱和路径），而较不常见的路径使用Λ 9-延伸、 Δ 8-去饱和和Λ 5-去饱和（称为Λ 9-去饱和路径）。这些连续的去饱和反应和延伸反应 可以ω6脂肪酸底物LA(如图1的左上部分（ω6)示意性示出的）或者ω 3底物ALA开 始，直到EPA(如图1的右下部分（ω 3)示出的）。如果对ω6底物LA进行初始Λ 6-去饱 和，三种酶的系列的LC-PUFA产物将为ω 6脂肪酸ARA。LC-PUFA合成有机体可使用如图1 的Λ 17-去饱和酶步骤所示的ω 3-去饱和酶将ω 6脂肪酸转化为ω 3脂肪酸，以用于将花 生四烯酸（ARA，20:4c〇6)转化为ΕΡΑ。ω3-去饱和酶家族的一些成员可作用于范围为LA 至ARA的多种底物。植物ω 3-去饱和酶常明确催化LA至ALA的Λ 15-去饱和，而真菌和 酵母ω 3-去饱和酶对于ARA Λ 17-去饱和为EPA可为特异的（Pereira等，2004a ;Zank等， 2005)。一些报道表明可存在非特异性ω 3-去饱和酶，其可将各种各样的ω 6底物转化为 其对应ω 3产物（Zhang等，2008)。
[0006] 在这些有机体中，通过EPA的Λ 5-延伸来产生DPA，然后通过Λ 4-去饱和来产生 DHA(图I)，从而进行EPA至DHA的转化。与此相反，哺乳动物使用所谓的"Sprecher"路 径，所述路径通过独立于Λ 4-去饱和酶的三个独立反应将DPA转化为DHA (Sprecher等， 1995)。
[0007] 通常可见于植物、苔藓、微藻和低等动物如秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)中的前端去饱和酶主要接受与磷脂酰胆碱（PC)底物的sn-2位置酯化的脂肪酸 底物。这些去饱和酶因此被称为酰基-PC、脂质连接的前端去饱和酶（Domergue等，2003)。 相比之下，高等动物前端去饱和酶通常接受酰基-CoA底物，其中脂肪酸底物连接至CoA， 而不是PC (Domergue等，2005)。已知一些微藻去饱和酶和一种植物去饱和酶使用与CoA酯 化的脂肪酸底物（表2)。
[0008] 每个PUFA延伸反应由通过多组分蛋白质复合物催化的四个步骤组成：首先，缩合 反应引起来自丙二酰-CoA的2C单元添加至脂肪酸，从而引起β -酮酯酰中间体的形成。 然后，这通过NADPH还原，然后脱水以产生烯酰基中间体。最终对此中间体进行第二次还原 以产生延伸的脂肪酸。通常认为，这四个反应的缩合步骤为底物特异性的，而其它步骤则不 是。实际上，这意味着只要引入对PUFA特异的缩合酶（通常称为"延伸酶")，原生植物延伸 机构就能够延伸PUFA，尽管原生植物延伸机构在延伸非原生PUFA底物中的效率可能较低。 在2007年，公布酵母延伸循环脱水酶的鉴别和表征（Denic和Weissman，2007)。
[0009] 植物、苔藓和微藻的PUFA去饱和天然发生于主要在酰基-PC库中的脂肪酸底物， 而延伸发生于酰基-CoA库中的底物。通过磷脂酶（PLA)进行来自酰基-PC分子的脂肪酸 至CoA载体的转移，同时通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（LPCAT)进行酰基-CoA脂肪酸至 PC载体的转移（图18) (Singh等，2005)。
[0010] 工稈化地产牛LC-PUFA
[0011] 使用需氧Λ 6-去饱和/延伸路径进行大部分LC-PUFA代谢工程化。在1996年 第一次报道使用来自集胞藻属（Synechocystis)藻青菌的Δ 6-去饱和酶在烟草中生物合 成Y -亚麻酸（GLA，18 :3 ω 6) (Reddy和Thomas, 1996)。最近，已在农作物如红花（在种子 油中的 73% GLA ;Knauf 等，2006)和大豆（28% GLA ;Sato 等，2004)中产生 GLA。LC-PUFA 如EPA和DHA的产生由于所涉及的增加数目的去饱和和延伸步骤而涉及更复杂的工程 化。通过Qi等（2004)第一次报道陆生植物中的EPA产生，他们将编码来自球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)的 Δ 9_ 延伸酶、来自眼虫藻（Euglena gracilis)的 Δ 8_ 去饱和 酶以及来自高山被孢霉（Mortierella alpina)的Δ 5-去饱和酶的基因引入到拟南芥属 中，从而产生高达3 % EPA。此工作随后由Abbadi等（2004)进行，他们报道在使用编码来 自小立碗藓（Physcomitrella patens)的Δ 6_去饱和酶和Δ 6_延伸酶以及来自三角褐指 藻（Phaeodactylum tricornutum)的Δ 5-去饱和酶的基因的亚麻仁杆中产生高达0.8% EPA。
[0012] DHA产生的第一次报道是在WO 04/017467中，其中描述3% DHA在大豆胚而不是 种子中产生，这通过引入编码异枝水霉（Saprolegnia diclina) Δ6-去饱和酶、高山被孢霉 Λ 6-去饱和酶、高山被孢霉Λ 5-去饱和酶、异枝水霉Λ 4-去饱和酶、异枝水霉Λ 17-去饱 和酶、高山被孢霉Λ 6-延伸酶以及路氏巴夫藻（Pavlova lutheri) Λ 5-延伸酶的基因来 实现。在也产生DHA的胚中的最大EPA水平为19. 6%，这指示EPA转化为DHA的效率较差 (W0 2004/071467)。这个发现与由Robert等（2005)公布的发现类似，其中从EPA至DHA 的转变较低，其中在使用斑马鱼Λ 5/6-去饱和酶、秀丽隐杆线虫Λ 6-延伸酶以及盐生巴 夫藻（Pavlova salina) Λ 5-延伸酶和Λ 4-去饱和酶的拟南芥属中产生3% EPA和0.5% DHA。而且在2005年，Wu等公布在使用畸雌腐霉（Pythium irregulare)A6_去饱和酶、 破囊壶菌（Thraustochytrid) Δ5-去饱和酶、小立碗藓Δ6-延伸酶、金盖菊（Calendula officianalis) Δ 12-去饱和酶、破囊壶菌Δ 5_延伸酶、致病疫霉（Phytophthora infestans) Δ17-去饱和酶、虹轉（Oncorhyncus mykiss)LC_PUFA延伸酶、破囊壶菌 Δ4-去 饱和酶以及破囊壶菌LPCAT的印度芥菜（Brassica juncea)中产生25% ARA、15 % EPA和 1.5% DHA (Wu 等，2005)。在 Venegas-Caleron 等（2010)和 Ruiz-Lopez 等（2012)中提供产 生合成ω 3 LC-PUFA的油籽农作物的努力的总结。如通过Ruiz-Lopez等（2012)指示的， 目前为止对于在转基因植物中产生DHA所获得的结果没有接近鱼油中所见的水平。
[0013] 因此，仍需要LC-PUFA在重组细胞中的更有效的产生，具体地为DHA在含油种子植 物的种子中的产生。
【发明内容】
[0014] 本发明人已确定用于产生具有高水平DHA的脂质的方法和植物。如PCT/ AU2013/000639中所描述的，本发明人先前已公开提取的植物脂质以及用于产生此类脂质 的植物和植物部分，在所提取的脂质的总脂肪酸含量中包含7%与20%之间的DHA。限定 20%的上限，因为此时这被认为是可在植物中产生的最大量的DHA。然而，本发明人意外地 发现在总脂肪酸含量中可获得大于20%的DHA水平。
[0015] 因此，在第一个方面，本发明提供一种产生提取的植物脂质的方法，所述方法包括 以下步骤：
[0016] i)获得植物部分，其脂质包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、 包括亚油酸（LA)的ω6脂肪酸、包括α-亚麻酸（ALA)和二十二碳六烯酸（DHA)的ω3脂 肪酸以及任选地十八碳四烯酸（SDA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十 碳四烯酸（ETA)中的一种或多种，其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为 20. 1%与35%之间，其中棕榈酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与16%之 间，并且其中肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平小于1% ;以及
[0017] ii)从所述植物部分提取脂质；
[0018] 其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1%与35%之间。
[0019] 在另一方面，本发明提供一种用于产生提取的植物脂质的方法，其包括以下步 骤：
[0020] i)获得包含脂质的植物部分，所述脂质包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含 油酸、棕榈酸、包含亚油酸（LA)和Y-亚麻酸（GLA)的ω6脂肪酸、包含 α-亚麻酸（ALA)、 十八碳四烯酸（SDA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十二碳六烯酸（DHA)的ω3脂肪酸以及任 选二十碳五烯酸（EPA)和二十碳四烯酸（ETA)中的一种或多种，其中DHA在植物部分的可 提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1%与30%之间或者20. 1%与35%之间，优选 为30%与35%之间；以及
[0021] ii)从所述植物部分提取脂质；
[0022] 其中DHA在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为20. 1%与30%之间或者 20. 1%与35%之间，优选地为30%与35%之间。
[0023] 获得植物部分或重组细胞的步骤可包括从产生所述植物部分的植物中收获所述 植物部分（优选为种子）、从此类细胞的培养物中回收重组细胞或者通过从生产者或供应 商购买或通过进口来获得所述植物部分或重组细胞。所述方法可包括确定脂质在植物部分 或重组细胞的样品中的脂肪酸组成或者提取的脂质的脂肪酸组成的步骤。
[0024] 在一个实施方案中，提取的脂质具有以下特征中的一个或多个或所有：
[0025] i)棕榈酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为2%与15%之间；
[0026] ii)肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为约0. 1%;
[0027] iii)油酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为1%与30%之间；
[0028] iv)亚油酸（LA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为4%与20%之 间；
[0029] V) α -亚麻酸（ALA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为4%与40% 之间；
[0030] Vi) γ -亚麻酸（GLA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为0. 05 %与 7%之间；
[0031] Vii)十八碳四烯酸（SDA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为 0· 05%与10%之间；
[0032] viii)二十碳四烯酸（ETA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于 6% ；
[0033] ix)二十碳三烯酸（ETrA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于 4% ；
[0034] X)所提取的植物脂质在其脂肪酸含量中包含小于0. 1%的ω6-二十二碳五烯酸 (22 5 Δ 4,7,10,13,16)
[0035] xi)新ω6脂肪酸在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平小于10% ;
[0036] xii)总ω6脂肪酸：总ω3脂肪酸在所提取的植物脂质的脂肪酸含量中的比率为 I. 0与3. 0之间或者0. 1与1之间；
[0037] xiii)新ω6脂肪酸：新ω 3脂肪酸在所提取的植物脂质的脂肪酸含量中的比率 为I. 0与3. 0之间、0. 02与0. 1之间或者0. 1与1之间；
[0038] xiv)所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少10 %的油酸至DHA的转化效 率；
[0039] XV)所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少15%的LA至DHA的转化效率；
[0040] XVi)所提取的植物脂质的脂肪酸组成是基于至少17%的ALA至DHA的转化效率；
[0041] xvii)所提取的植物脂质中的总脂肪酸具有小于I. 5% C20 :1 ;
[0042] xviii)所提取的植物脂质的三酰甘油（TAG)含量为至少70% ;
[0043] xix)所提取的植物脂质包含含有DHA的二酰甘油（DAG);
[0044] XX)所提取的植物脂质包含小于10%游离（未酯化的）脂肪酸和/或磷脂，或者 基本上不包含它们；
[0045] xxi)以TAG形式酯化的至少70% DHA处于所述TAG的sn-Ι或sn-3位置；
[0046] xxii)在所提取的植物脂质中最丰富的含有DHA的TAG种类为DHA/18 :3/18 : 3 (TAG 58 :12);以及
[0047] xxiii)所提取的tt物糙/mr三.-DHA TAG <TAG 66:⑶h
[0048] 在一个实施方案中，二十碳五烯酸（EPA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中 的水平为〇. 05%与10%之间。
[0049] 在另一个实施方案中，二十二碳五烯酸（DPA)在所提取的植物脂质的总脂肪酸含 量中的水平小于4%。
[0050] 在另一个实施方案中，DHA在所提取的植物脂质的总脂肪酸含量中的水平为 20. 1%与30%之间。
[0051] 在另一个实施方案中，提取的脂质具有以下性质中的一个或多个或具有所有以下 特征
[0052] i)棕榈酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约2%与18%之间、约2% 与16%之间、约2%与15%之间或者约3%与约10%之间；
[0053] ii)肉豆蘧酸（C14 :0)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于6%、小于 3%、小于2%、小于1%或约0. 1% ;
[0054] iii)油酸在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约1%与约30%之间、约 3%与约30%之间、约6%与约30%之间、1 %与约20%之间、约30%与约60%之间、约45% 至约60%、约30%或者约15%与约30%之间；
[0055] iv)亚油酸（LA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4%与约35%之 间、约4%与约20%之间、约4%与17%之间或者约5%与约10%之间；
[0056] V) α -亚麻酸（ALA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4%与约40% 之间、约7%与约40%之间、约10%与约35%之间、约20%与约35%之间、约4%与16%之 间或者约2%与16%之间；
[0057] vi) Y-亚麻酸（GLA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于4%、小 于约3 %、小于约2 %、小于约1 %、小于约0. 5 %、0. 05%与7%之间、0. 05 %与4%之间、 0. 05%与约3%之间或者0. 05%与约2%之间；
[0058] vii)十八碳四烯酸（SDA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于约 10%、小于约8%、小于约7%、小于约6%、小于约4%、小于约3%、约0. 05%与约7%之间、 约0. 05 %与约6 %、约0. 05 %与约4%之间、约0. 05 %与约3 %之间、约0. 05 %与约10 %之 间或者0.05%与约2%之间；
[0059] viii)二十碳四烯酸（ETA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于6%、