一种酶法制备左旋多巴的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备左旋多巴的方法，特别涉及到一种酶法制备左旋多巴的方法，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002]左旋多巴(L-DOPA)，化学名称为3，4_ 二羟基苯基丙氨酸，是L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。L-DOPA的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治疗获得明显疗效。L-DOPA及复方左旋多巴(如美多芭)已成为治疗常见老年病帕金森氏病的最有效的药物。左旋多巴还可用来治疗弱视、肝昏迷、心力衰竭等病症；此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的功效。鉴于L-DOPA在医药卫生、保健美容等诸多领域的显著功效，L-DOPA的生产很早就被人们所关注，预计未来几年左旋多巴的全球销售额会超过10亿美元，市场容量巨大。
[0003]根据文献报道左旋多巴的生产有天然植物提取法、化学合成法及微生物酶转化法三种主要方法。
[0004]1、提取法
天然植物提取是从猫豆、藜豆等种子中提取，虽然猫豆等植物中存在的多巴都是左旋的，提取过程中免去了与手性异构体D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量小的限制，因而生产成本较高，难以大规模生产，远不能满足市场需求。
[0005]2、化学法
工业化生产左旋多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经过8步的反应制得。尽管目前商品化左旋多巴主要通过不对称法合成，但化学合成过程中需要大量的金属催化物，并且过程繁杂，产物的转化效率和旋光活性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。
[0006]3、酶转化法 O酪氨酸酚解酶
酪氨酸酸解酶(tyrosine phenol lyase，TPL) (EC4.1.99.2)可催化苯酸、丙酮酸和氨水生成酪氨酸，该反应为可逆反应。若将苯酚置换成邻苯二酚，该酶即可催化生成左旋多巴。Yanada等对Erwinia herbicola ATCC21434合成左旋多巴进行了深入的研宄，但前体物对酶反应有较强的抑制作用，甚至导致酶的不可逆失活，且产物和原料丙酮酸容易生产副产物，影响产率。
[0007]2)转氨酶
转氨酶(transaminase)可将L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基转移到3，4-二轻基苯丙酮酸上，进而生成左旋多巴。Nagasaki等(Agriculture B1logy and Chemistry,1975，39:363-369.)研宄了 Enterobacter cloacae NB320，Alcaligenes faecalis 转氛基作用生成左旋多巴的能力。然而由于转氨作用存在诸多问题，随后相关利用转氨酶生成左旋多巴的研宄比较少见。
[0008]3)酪氨酸酶
酪氨酸酶(tyrosinase)可以酪氨酸直接作为底物，催化合成左旋多巴。1973年，日本的 Yoshida 等(Agriculture B1logy and Chemistry,1973,37:2121-2126.)用Vibr1 tyrosinaticus ATCC19378, 1989年武汉大学的彭珍荣等(氨基酸和生物资源，1996,4:1-4.)用假单胞菌属细菌以酪氨酸为前体生产左旋多巴。彭珍荣的方法中酪氨酸酶的活性低，最高仅能将8.6g/L的酪氨酸转化为7.8g/L的左旋多巴，再加入高含量的酪氨酸无法实现有效转化，产物浓度较低，分离提取困难。日本的Yoshitake TanakaCAg1.B1l.Chem.38(3)，633-639，1974)还以诱变育种的方法提高了产酶性能，转化后左旋多巴在转化液中的浓度为21g/L，但是该方法酪氨酸摩尔转化率不足70%，底物酪氨酸大量残留，分离提取困难，距离工业应用具有相当的距离。
[0009]由此可以看出，目前公开的酪氨酸酶转化酪氨酸制备左旋多巴的方法存在产量低或者转化率低的问题，使产品收率低、分离提取困难，生产成本高，操作工艺较复杂，不利于产业化。
【发明内容】
[0010]针对现有技术中酪氨酸酶转化酪氨酸制备左旋多巴方法存在的不足，本发明提供了一种酶法制备左旋多巴的方法，该方法酪氨酸转化率高，左旋多巴浓度也高，具有工业化实用价值。
[0011]本发明可以通过以下技术方案实现:
一种酶法制备左旋多巴的方法，包括以下步骤:
(1)挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia )的菌种斜面，接入种子培养基中培养，得一级种子液；
(2)将一级种子液以3?10%的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵结束后离心，收集菌体细胞；
(3)在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18?30°C，pH5.0?6.0条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴。
[0012]上述方法中，优选采用嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806作为产酪氨酸酶的菌种。
[0013]上述方法中，所用种子培养基由以下重量百分比的组分组成:葡萄糖1.2-2.0%，蛋白胨0.3-0.8%，氯化钠0.3-0.8%，氯化铵0.1-0.5%，玉米浆0.8-1.2%，豆饼水解液0.5-1.5%，水余量，pH7.0o
[0014]上述方法中，所用发酵培养基由以下重量百分比的组分组成:葡萄糖1.5-2.5%,氯化铵0.5-1%，硫酸镁0.02-0.05%，磷酸二氢钾0.08-0.12%，氯化钙0.008-0.012%，硫酸铜0.01-0.03%，玉米浆0.5-1.5%，豆饼水解液(又名豆浓)0.1-0.5%，水余量，ρΗ7.0。
[0015]上述方法中，种子培养基优选由以下重量百分比的组分组成:葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，氯化铵0.3%，玉米浆1%，豆饼水解液1%，水余量，ρΗ7.0。发酵培养基优选由以下重量百分比的组分组成:葡萄糖2%，氯化铵0.7%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钙0.01%，硫酸铜0.02%，玉米浆1%，豆饼水解液0.3%，水余量，pH7.0。当采用优选的种子培养基和发酵培养基时，会提高左旋多巴的含量和酪氨酸的转化率。
[0016]上述方法中，步骤(I)种子培养时，优选采用以下条件:28?32°C，150?200r/min培养24?26h。
[0017]上述方法中，步骤(2)发酵培养时，优选采用以下条件:搅拌转速200?700r/min，溶氧20?50体积％，温度28?30°C，培养36?38h。
[0018]上述方法中，步骤(2)中，发酵结束后将发酵液用冷冻离心机在0°C、8000r/min离心lOmin，收集菌体细胞。
[0019]上述方法中，步骤(3)中的缓冲溶液可以选自:乙酸-乙酸盐缓冲溶液或Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
[0020]上述方法中，每100ml缓冲溶液中加入10-25g的酪氨酸。采用优选菌种时，10-25g/L的酪氨酸的转化率可达到90%以上，例如每100ml缓冲溶液中加入20_25g的酪氨酸时，酪氨酸的转化率也能达到90%以上。
[0021]上述方法中，每100ml缓冲溶液中加入40_60g菌体细胞，用于转化酪氨酸。
[0022]上述方法中，步骤(3)中，采用的表面活性剂为曲拉通XlOO或吐温-80，还原保护剂为亚硫酸钠或抗坏血酸。
[0023]步骤(3)中，表面活性剂在缓冲溶液中的浓度为0.01?0.3wt%,还原保护剂在缓冲溶液中的浓度为0.1?2wt%，硫酸铜在缓冲溶液中的浓度为0.01?0.lwt%。
[0024]上述步骤(3)中，酪氨酸可以一次性加入缓冲溶液中，也可以分多次加入缓冲溶液中。
[0025]进一步的，为了更好的提高酪氨酸的转化率和左旋多巴的产量，在步骤(3)酶促反应将酪氨酸转化为左旋多巴的过程中，本发明采用间歇弱通风的方式辅助酶促反应的进行，所述间歇弱通风的方式是指:反应过程中每小时通空气15-20min，通气量为0.1vvm?0.5vvm(vvm的意思是每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)。通过在酶促反应过