用于评估香料或香料混合物香味性能的方法
【专利说明】用于评估香料或香料混合物香味性能的方法 发明领域
[0001] 本发明属于香味和气味领域并且涉及一种通过将香料或香料混合物暴露于特定 的嗅觉受体评估和鉴别其香味性能的方法
【背景技术】
[0002] 人类的嗅觉系统具有识别和区分大量不同化学成分和气味分子的优异能力。由于 气味物质能够唤起记忆和情感或者影响我们的情绪，作为化学传感器的嗅觉系统有助于社 会行为和性行为以及生活品质。
[0003] 气味感知始于气味分子和在嗅神经（olfactory sensory neuron，0SN)中表 达的嗅觉受体之间的化学相互作用。这些神经位于被粘膜层覆盖的嗅上皮（olfactory epithelium，0E)，该粘膜层为嗅上皮的表面提供富含液体/蛋白质的分泌物。人类鼻腔的 大部分由纤毛柱状呼吸上皮组织构成。排布筛板的鼻腔上部由OSN组成。OSN是双极细 胞，其具有单一无分枝树突（dendrite)和穿经筛板抵达大脑嗅球的轴突（axons)。僧帽 细胞的轴突随后离开嗅球（OB)抵达高级脑区，包括梨状皮层（piriform cortex)，海马体 (hippocampus)和杏仁孔（amygdale)。由每个OSN的球突伸出约10-25根纤毛，每根约5 μ m 长。每个OSN仅表达一类嗅觉受体（OR)蛋白，其为化学-感觉转导主要过程的第一级。
[0004] 嗅觉系统作为鼻部分子解码器的重要组成之一能够通过嗅觉受体区分数千种化 学成分。0R，如视蛋白，苦味和甜味味觉受体（TAS2R1和TAS1R1)以及犁鼻器受体（VIRs， V2Rs和V3Rs)，由大的基因超家族编码，属于G-蛋白-偶联受体（GPCRs)。它们由一些特 征基序（sequence motifs)识别并构成哺乳动物基因组中的最大基因家族。GPCRs具有7 个α-螺旋跨膜（TM)区的共同结构特征。它们可根据序列相似性分为6组，并且OR基因 属于视紫红质类GPCR超家族中最大的一组。
[0005] 基因超家族编组为18个基因家族和300个亚家族并且位于分布在除了 20号染色 体和Y染色体的所有常染色体上的不同尺寸的多簇上。两个最大的OR基因簇位于11号染 色体，其中Ilq上有38个功能基因，Ilp上有44个功能基因。基于类似氨基酸序列的百分 比，OR基因可以被编入特定家族并进一步编入亚家族。具有MO %蛋白序列同源性的OR被 认为在相同家族中，并且如果它们共有>60%，则属于相同的亚家族。根据这一概念，OR基 因由雨果基因命名委员会（HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)分类。
[0006] OR平均长度为约310个氨基酸。OR基因序列显示出跨膜螺旋3-6旁系同源基因的 巨大多样性，可能引起配体特异性的高度多样性。有一些OR特征的功能域（motifs)。一种 这类功能域是"MAYDRYVAIC' "，位于TM3与TM3和TM4之间胞内环（intracellular loop) 的接合点。在该功能域内，三个氨基酸'DRY'（天冬氨酸-精氨酸-络氨酸）的弹性，在视 紫红质类GPCRs中高度保留。DRY功能域可能对G-蛋白偶联十分重要。可能在OR组库 (r印ertoire)中，接触位置表现出旁系之间的显著变化。随后的研宄已经尝试基于序列分 析考察嗅觉受体中的气味结合残基。一些方法共同预测了 22个位于其模型中TMs 3至7 的假定接触残基。在最近的研宄中，通过将动态同源建模与定点突变以及功能分析结合，提 供了配体结合位点的分子模型，从而基于计算信息预测受体功能。
[0007] 分尚伪基因（分尚伪基因，SPG)
[0008] 人类OR含有大量伪基因，其中多于50%的基因位点（loci)由于框架破坏突变是 无功能的。
[0009] 人类的一部分嗅觉受体可以被分为嗅觉受体的完整形式和伪基因形式。换句话 说，一些嗅觉受体基因同时表达功能和非功能等位基因（allels)，其被称为分离伪基因。它 们被解释为人类群体中由于单一核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP) 的破坏分为完整基因和伪基因。这种分离突变可以引入终止密码子，或改变对于蛋白质适 当功能重要的高度保留的氨基酸。
[0010] 2003 年由 Gilad 和 Lanet 第一次作出的研宄（Mol. Biol. Evol 20 (3)，p. 307-314(2003))显示了人体中的12个SPGs。其结果表明俾格米人（Pygmies， 一种非洲人种）中完整等位基因的发生率大于高加索人种。同年Menashe等人（Nat. Genet. 34(2)，p. 143-144(2003))推算出分离嗅觉受体伪基因在整个人类基因组中的数量 至少为60。他们发现非洲裔美国人比非非洲裔参与者有更多功能ORs。当2012年Lancet 的小组报道了个体间OR基因组库中异常高的遗传多样性，并认为单个人类有高度个人化 的功能嗅觉受体"条形码"，SPGs的数量跃升至244。在Olender的研宄中每个人类个体都 通过这类SPGs的不同组合而个性化。最被接受的假设之一是OR基因的等位基因变异可产 生不同的功能特征，这些特征可在人类群体中导致不同气味敏感表型（phenotypes)的产 生。一项SPGs和气味敏感性的相关性研宄表明0R11H7P基因形式与对异戊酸敏感性之间 的高度相关性，杂合或纯合的0R11H7P完整等位基因比纯合的被破坏的等位基因更可能 对异戊酸高渗。可以提到去孤儿化ORs的潜在配体通常可用于相关性研宄，从而确定单个 嗅觉受体破坏和气味感觉多样性之间的详细关系。
[0011] 拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV)
[0012] 由基因组重排引起的CNVs可借助不同的分子机制，如基因计量，基因阻断，基因 融合和位置效应或隐性等位基因的解隐藏（unmasking)，产生表型。CNVs与表型之间的一 些相关性包含于人类疾病之中。最知名的例子是由人类21号染色体三体化导致的唐氏综 合症；另一个例子是由于阿尔法珠蛋白基因重排导致的地中海贫血症。
[0013] CNVs已经被定义为"lkb或更大的DNA片段并且与参比基因组相比表现出改变的 拷贝数"。基于功能定义该解释被改变，并且有人建议我们应当选择平均的外显子尺寸（~ IOObp)作为定义CNV的参数。拷贝数变异是人类遗传多样性的根源。当缺失，插入或复制 的断点位于功能基因中，它可能阻断基因，并通过如红绿视蛋白基因所表达的基因失活导 致功能缺失和色盲。
[0014] 在全基因组研宄中，检测了大量OR基因或基因簇的CNVs。在之前的研宄中，系统 研宄了 OR基因的个体CNVs。在大约50个人类个体的小组中确定了 18个ORs的拷贝数变 异。除了参比基因数据没有一个个体具有全部数量的功能OR基因并且几乎每个个体都有 ORs功能缺失和获得的独特组合，因此说明CNVs产生了 OR基因的个体模式。在Waszak进 行的研宄（PLos. Comput. Biol. 6 (ll)pp e100 0988 (2010))中报道了包括 CNVs 和 SNPs 的有 害变异分别影响了 15%和20%的人类OR基因组库。他们揭示了 OR基因位点在个体中通 过OR基因位点中0至9次拷贝表现出大范围的位点拷贝数。Olender在2012年的研宄表 明完整基因位点的CNVs数量增加至66%。他们报道了在851个人类基因组OR基因位点 中，438个具有显然固定于整个人类群体中的框架破坏伪基因。剩下的413个基因位点中， 271个（66% )在完整开放的阅读框架上含有至少一个等位基因缺失，包括框架破坏和CNV 等位基因缺失。
[0015] 这些拷贝数变异的出现可以通过基因复制或外显子改组，导致特定基因家族中以 及在全基因组范围上的基因组结构变异。因此，CNVs可能是人类个体间嗅觉能力显著差异 的原因之一。然而，CNV与气味感知之间的关系仍未评估。
[0016] 嗅觉信号转导途径
[0017] 在哺乳动物OSN中信号转导的经典途径由作为变量成分的OR和四个常量成分组 成：含G a olf的异三聚体G蛋白；腺苷酸环化酶，其产生第二信使cAMP ;环核苷酸门控阳离 子通道和钙激活氯通道。嗅神经通过被称为Gaolf的特定亚基表达G-蛋白。Gaolf通过激 动子结合至OR激活嗅觉特异腺苷酸环化酶，其导致cAMP的活化。该级联（cascade)后通 过提高cAMP水平打开环核苷酸门控通道。钝性OSNs通常在其质膜上保持约-65mV的静息 电位（内部相对于外部）。通道开孔通过钠离子（Na+)和钙离子（Ca2+)流入使神经元膜去 离子化。Ca2+_流也使Ca2+_依赖-Cl-通道打开，其增强了细胞膜的去离子化并产生沿着 感觉轴突的作用电位，使信号传输至嗅球。
[0018] 腺苷酸环化酶（AC) /cAMP途径对脊椎动物的嗅觉反应至关重要。然而气味物激活 了多余一个的转导级联；IP3也被证明是有效的第二信使。多嗅觉信号途径这一概念出现 的关键是在生化分析中观察到一些气味没有引起cAMP的增多。该"非-cAMP气味"反而在 嗅觉细胞中引起磷酸肌醇信号。对于不同物种已经报道1，4, 5-三磷酸肌醇（InsP3)也可能 参与嗅觉。2005年这一问题得到解释，不同人群中磷酸酰肌醇相关信号蛋白，包括磷脂酶C beta 2(PLC b2)，InsP3-II