可用于检测与大肠癌相关的SLCl9A1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大 肠癌相关的51〇划7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 大肠癌（Colorectal Cancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。 目前研宄表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发 生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近 年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我 国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且，发病年龄明显提前。世界卫生组织（WHO)发布 的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其 中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治 疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总 体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及 时的诊断，后期又因发生转移，而无法进行手术治疗。发生淋巴结转移的大肠癌患者应用伊 立替康加氟嘧啶化疗药物，缩小肿瘤大小，使其能够达手术指针。但是只有30%-50%的患者 对该药物有明显的疗效。因此，有必要探索其他分子指标检测，判断患者对药物的反应性， 及早选择恰当的治疗方案，提高大肠癌患者总体生存率。
[0003] 溶质运载蛋白家族成员 19A1 (solute carrier family 19，member 1，5ZC7划7) 位于21号染色（chr21:46934629-46954529)，其编码叶酸载体蛋白能介导细胞对叶酸的吸 收，调控细胞内叶酸的浓度。有研宄表明，处于高浓度叶酸的大肠癌细胞，对化疗药物的敏 感性减弱。并且有报道，溶质运载蛋白家族成员19A1 (solute carrier family 19，member 1，5ZC7划7)基因的多态性与大肠癌患者对化疗药的敏感性相关，可用于对大肠癌患者的 预后评价。目前，国内外尚无关于大肠癌与溶质运载蛋白家族成员19A1 (solute carrier family 19，member 1，5167划7)基因启动子区甲基化相关性研宄和在大肠癌中用于检测 溶质运载蛋白家族成员19A1 (solute carrier family 19，member 1，5ZC7划7)基因启动 子区甲基化程度的检测试剂盒相关研宄报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可 用于检测与大肠癌相关的5ZC7划7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 5ZC7划7甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助 诊断大肠癌。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的 划7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括5ZC7划7基因启动子区甲基化特异性扩 增上游引物、下游引物及其未甲基化特异性扩增上游引物和下游引物，其中所述的甲基化 特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' _TTGTTGTAGCGGTGTTGGAAGG_3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -TCCGCCGCAACCTACGAAT-3' ； 所述的未甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -TTTGTTGTAGTGGTGTTGGAAG-3' ； 所述的未甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示： 5' -TTCCACCACAACCTACAAAT-3'。
[0006] -种可用于检测与大肠癌相关的5ZC7划2基因启动子区甲基化程度的试剂盒的 应用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0007] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与大肠癌 相关的510划7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含 5ZC7划7基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、甲基化特异性扩增下游引物及其未 甲基化特异性扩增上游引物、未甲基化特异性扩增下游引物，溶质运载蛋白家族成员19A1 基因启动子区域的高甲基化水平导致大肠癌患者溶质运载蛋白家族成员19A1基因低表 达，从而导致大肠癌细胞具有更强的侵袭能力，影响大肠癌患者的预后。因此，溶质运载蛋 白家族成员19A1基因启动子区甲基化情况能用作大肠癌恶性程度和预后评价的分子生物 学标记，以检测大肠癌5ZC7划2基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，对大肠癌恶性程度和预后判断，检测效率高，针对 性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。
【附图说明】
[0008] 图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳成像图； 图2为PCR产物测序结果图。
【具体实施方式】
[0009] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0010] 1、研宄对象的收集 本研宄选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研宄对象。 所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。 手术切除大肠癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5cm以上的正常组织）立即保存于-80 度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研宄对象都签署知情同意书。
[0011] 2、基因组DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fisher Scientific)检测 所得DNA的浓度，以供溶质运载蛋白家族成员19A1基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
[0012] 3、DNA甲基化测定 本实验采用甲基化特异性链式聚合反应技术对原钙粘附蛋白伽马亚家族A12基因启 动子区序