一种扩张床吸附(eba)技术制备纤维蛋白原的工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质的制备方法，具体涉及制备纤维蛋白原的方法。
【背景技术】
[0002] 血液制品（boold products)，是指由健康人血衆或经特异免疫的人血衆，经分离、 提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成份。目前，按照血液制品 不同作用，可将其分为人血白蛋白、免疫球蛋白类、凝血因子类、特殊蛋白及微量蛋白和纤 维蛋白粘合剂五大类。而促成以上各类产品不同市场占有率，除了受市场供需因素外，另一 个重要的因素就是分离技术。
[0003] 二战时期，由Cohn研发的低温乙醇法正式开启了血液制品分离纯化的先河，并对 后续血液制品纯化产生了深远的影响，是世界血浆蛋白分离工业化生产的基础。但是，随着 科技的进步以及社会多元化需求，要不断有新的技术加入到血液制品分离纯化中，如离心 法、辛酸盐沉淀法、压滤法、层析法、超滤法等。其中以层析技术的加入，从根本上改变了原 有技术分离时间长、步骤繁琐、分离效果差、产品种类少、自动化程度低等缺点，有效的提高 了原料血浆的利用度及使用安全性，丰富了产品的种类。据报道，国外已能从血浆中有效分 离出近20余种产品，并有10余种处于研发或临床试验阶段，而我国因分离技术起步晚，虽 然多数企业也在血液制品分离纯化中引入层析技术，但多处于实验阶段，并未运用于大规 模工业化生产中。目前，我国血液制品制备仍以低温乙醇法为主，且产品局限于血浆中含量 较大且易纯化的白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、凝血VIII因子等10余种产品。因此，如 何通过层析技术改变我国分离技术薄弱局面，从而提高分离效果，增加分离组分是我国血 液组分分离工作创新重点。
[0004] 纤维蛋白原是一个分子量340000,长度约46nm的纤维状蛋白。纤维蛋白原是二聚 的蛋白质，每个分子含有6条两两相同的肽键，分别称为α链、β链和γ链，每一半由称 为A a、B β和γ的二硫键合成的多肽链组成，由29个二硫键将6条肽键交联成一个对称 分子，肽链的N末端部分集中在中间，它们的C末端对称地分步在分子的两端。其主要形 式是分泌到循环中，在其从肝中分泌之后，所述蛋白不但存在于血浆中，而且存在于淋巴和 组织间隙液中。
[0005] -般在健康的人体中，纤维蛋白原主要由肝脏实质细胞合成，大部分存在于血浆 中，只有15%存在于血管外，在血浆中的浓度为4~10 μΜ，但是当在生理应激反应期间，其 浓度可以增加至多400 %，半衰期为96-144小时。生理止血需要量为正常水平的25-50 %。 临床上主要用于止血和凝血，广泛用于先天性纤维蛋白原减少和缺乏症；获得性纤维蛋白 原减少症、如肝损伤，产后大出血，肝硬化，外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏造成的 凝血障碍。
[0006] 凝血因子类蛋白中，除纤维蛋白原外，其他凝血酶原、凝血因子VII、VIII、IX、XI、 XIII等含量均较少，大致为Ι-lOmg/dl，且常温下化学性质也不稳定，因此，以往通过改良 的Cohn法或Kistler-Nitschmann法不能高效分离出大多数凝血因子类产品，另外即使获 得了高纯度产品，因工艺问题会使其安全性存在一定隐患。如德国CSL公司采用氢氧化铝 吸附剂甘氨酸沉淀虽获得高纯度Fg，但产品因引入Al，而限制了其使用。而层析技术的加 入，尤其是亲和层析及离子交换层析技术，对于该类蛋白的纯化起到了重要的作用，它们或 使原有的纯化条件更为温，或另辟新径的开发出新的产品，提高了产品的活性及纯度，并减 少了时间投入及经济成本。
[0007] 对于凝血酶原复合物（prothrombin complex concentrate, PCC)分离，层析技 术依然占有主要地位，如包正琦（微生物学免疫学进展，2013, 41 (4) :79-84.)等指出，目 前DEAE S印hadex A - 50凝胶仍是国内外纯化PCC的首选工艺。因此，曹海军（中国输 血杂志，2012, 25 (7) : 655-660)等对可能影DEAE-S印hadex A50吸附能力各三个因素进行 探讨，并发现在柠檬酸钠（〇· 02-0. 028)mol/L，氯化钠（0· 02-0. 06)mol/L，ρΗ6· 6-6. 9 时， 介质的吸附效果最佳。而刘欣晏（中国生化药物杂志，2008, 29 (1):26-29)等认为若一次 无法有效分离，可进行二次分离即进行两次DEAE-Sephadex A50及S/D法病毒灭活操作， 在保证各凝血因子回收率为70%-80%同时，提高了产品的纯度。另外，GE公司指出，也 可将两步DEAE-Sephadex A50中第二步介质改为高流速Capto Q介质，即将冷沉淀上清按 DEAE-S印hadex A50吸附、S/D处理、Capto Q吸附处理，该工艺通过提高工艺载量及处理 速度，从而显著提高生产效率。何淑琴等（安徽农业科学，2013, 41 (17) :7420-7422)采用 DEAE-S印hadex A50 凝胶、DEAE-S印harose Fast Flow 凝胶、DEAE-纤维素对 PCC 提取工 艺进行改进，并对凝血因子II、W、IX、X回收率进行分析，分别为84. 9%、76. 4%、82. 8%和 78. 7%〇
[0008] 此外，对于纤维蛋白原（Analytical biochemistry, 2010, 399 (1) : 102-109)，凝血 酶、von Willebrand因子复合物、凝血因子IX分离中，均因为层析技术的加入，使得产品在 活性及纯度上有明显的提高。但是，并不是只有经层析技术即可分离出高收率及高活性的 蛋白，如法国LFB公司的Clottafact工艺，是以乙醇冷沉淀组分I为起始，经S/D灭活病毒、 DEAE吸附，并经35nm膜过滤获得纤维蛋白原成品，但该法收率较低，仅回收了 40%。因此， 对于纯化工艺仍需按照待分离组分进行条件摸索并中和分析和衡量各种因素，才能使分离 效果达到最优化。
[0009] 中国专利申请CN200810046747. 5公开了人纤维蛋白原制剂的制备方法，该专利 采用的基本是传统的低温乙醇沉淀技术，只是增加了一个高温（99. 5°C)的干热灭活病毒 工艺。中国专利申请CN201110078557.3公开了柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原 的方法，但该方法的原料从组分I开始，还是依靠低温乙醇沉淀技术，工艺在传统工艺基 础上最后一步采用一次柱层析技术（DEAE-650M介质）。中国专利申请CN201110188019. X公开的纤维蛋白原的制备方法也主要是以传统的低温乙醇技术为核心，创新处是加入了 助剂，如抗凝剂：柠檬酸三钠或草酸钾；如灭活剂：磷酸三丁脂和吐温80 ;如溶解剂：磷酸 氢二钠缓冲液体系、碳酸缓冲液体系、柠檬酸缓冲液体系，该工艺没有采用柱层析技术作 为纯化步骤。中国专利申请CN201310285991.8公开了从人组分沉淀中提取人凝血因子 VIII和人纤维蛋白原的工艺，该工艺是从组分I即传统的低温乙醇工艺为核心技术，创新 之处为可将凝血因子VIII和组纤维蛋白原共沉淀，更好的利用了原料血浆。中国专利申请 CN201410524351. 2公布了一种从冷沉淀中提取凝血因子VIII的废料中提取人纤维蛋白原 的制备工艺，创新处是结合乙醇沉淀技术和离子交换层析（DEAE介质），并采用AT-III灭活 凝血酶、EDTA除Ca2+及纳米滤膜过滤去除病毒，以上措施虽然有助于减少纤维蛋白原激活 为纤维蛋白及避免化学试剂的使用，提高了产品使用的安全性及活性，但仍以冷沉淀为起 始分离物，且以二次低温乙醇沉淀为核心技术仍未有改变。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是应用扩张床吸附层析技术（EBA)从血浆中制备纤维蛋白原，实 验合成的阴离子交换介质作为填料，原料血浆不用处理直接经过EBA层析技术作为纯化工 艺第一步骤，通过该步骤后可以将原料血浆初步分成四个组分：非吸附血浆组分和析出液 含有α - 1蛋白酶抑制剂（a -1-PI);洗脱组分1主要是白蛋白（Albumin)组分；洗脱组 分2主要是免疫球蛋白（IgG);洗脱组分3主要是纤维蛋白原（Fibrinogen)，与传统工艺和 以上专利公布的工艺比较较大提高了原料血浆的综合利用度。再经过酸沉除杂、S/D灭活 病毒、MacroCap Q柱层析、过滤工艺纯化纤维蛋白原。
[0011] 根据本发明的一方面，一种制备纤维蛋白原的方法，包括下述步骤：
[0012] 1)以琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质为柱层析填料，制备扩张床作用层析柱；
[0013] 2)将血浆过步骤1)所述的层析柱进行初步纯化，收集纤维蛋白原初品；
[0014] 3)将步骤2)获得的纤维蛋白原初品进行酸沉去除杂质；