连， 获得乙肝病毒多表位融合志贺毒素蛋白（SEQ ID No. 1)。利用志贺毒素靶向树突状细胞的 特性，有效增强机体的CTL应答，清除乙肝病毒。
[0031] 二、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备
[0032] 1、重组质粒 pET300-STXB-EP 的构建
[0033] 根据乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的氨基酸序列，设计其编码核苷酸序 列 STXB-EP (SEQ ID No. 2)以及 PCR 扩增引物：上游引物 STXB-EP-F :5'-tcccatgggagccgca tgccctcta_3'（SEQ ID Νο·3);下游引物STXB-EP-R:5'-gttctagattatcggaagattacct_3'（S EQ ID No. 4)，委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成。
[0034] 以合成的STXB-EP序列为模板，采用引物STXB-EP-F和STXB-EP-R进行PCR扩增， 扩增条件为：先94°C预变性2分钟，再94°C变性30秒、65°C退火30秒、72°C延伸lmin，共 33个循环，最后72 °C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定（图1)后，切胶回收纯化 目的DNA片段（465bp)。将所得目的DNA片段用NcoI和XbaI双酶切，再与经同样双酶切 的质粒pET300/NT-DEST(invitrogen公司）在T4DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒 PET300-STXB-EP。经NcoI和XbaI双酶切鉴定（图2)，所得重组质粒pET300-STXB-EP中含 有目的DNA片段。
[0035] 2、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的原核表达与纯化
[0036] 将重组质粒pET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含有 100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。挑取一个阳性克隆即PET300-STXB-EP转 化菌，分别于温度16、25、37°C诱导目的蛋白表达，诱导剂IPTG的终浓度分别为0. 1、0. 3、 0. 5、0. 7、lmmol/L，诱导时间分别为2、3、4、6小时。表达产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示， 在温度37°C、诱导剂终浓度为lmmol/L、诱导时间为4小时的条件下，pET300-STXB-EP转 化菌成功表达了携带组氨酸标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，且表达量最高 (图 3)。
[0037] 利用表达产物携带的组氨酸标签进行亲和纯化：取冻存的pET300-STXB-EP转化 菌菌液100 μ 1，加入新鲜培养基10ml，37°C培养过夜，再取新鲜菌液lml，加入新鲜培养基 10〇1111，37°0培养2.5小时，再加入终浓度为1臟〇1/1的1?了6,37°0诱导培养4小时，收集 菌体，1000 Orpm离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细菌裂解液IOml和终浓度为lmmol/ L的苯甲基磺酰氟（PMSF)，超声至溶液变清澈，18000rpm离心15分钟，取上清，过Ni2+亲 和层析柱，先用柱清洗液洗柱3次，再用含有200mmol/L咪唑的上样缓冲液洗脱，收集洗 脱液，用0.0 lmol/L PBS透析去除咪唑和盐离子等，用TEV蛋白酶酶切去除His标签后过 S印hadex-G75分子筛，收集通过峰，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白（图4)。
[0038] 实施例2、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的免疫保护作用
[0039] 取HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因小鼠70只，平均分为7组：①乙肝病毒多表 位与志贺毒素的融合蛋白组（STXB-EP):以乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白为免疫 原；②乙肝病毒多表位融合肽与志贺毒素的混合物对照组（STXB+peptides):以乙肝病毒 多表位融合肽与志贺毒素按摩尔比1:1的混合物为免疫原；③志贺毒素对照组（STXB):以 STXB为免疫原；④乙肝病毒多表位融合肽对照组（p印tides):以乙肝病毒多表位融合肽 为免疫原；⑤非治疗对照组（blank) :0.0 lmol/L PBS缓冲液；⑥安慰剂对照组（placebo): 灭菌双蒸水；⑦乙肝病毒VLP疫苗（在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位氨基酸之间插 入由 HBsAg313-321、HBsAg335-343、Poll50-159、Pol455-463 和 Padre 表位通过连接肽串 联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽）。各组免疫方法如下：小鼠尾部皮下注射免疫原， IOOyg/次/只，1次/周，共免疫3次。
[0040] 利用定量PCR试剂盒（吉玛公司）检测各组小鼠 HBV DNA的拷贝数，利用免疫组 化试剂盒（碧云天）检测肝细胞HBcAg表达。结果显示，在HLA-A*0201和HLA-A*1101转 基因小鼠中，与其它对照组相比，乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白组的HBV DNA拷贝 数和HBcAg表达量均明显下调（图5)，说明乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白存在显 著的免疫保护作用，并存在广谱性，同时该疫苗明显优于乙肝病毒VLP疫苗。
[0041] 实施例3、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白靶向树突状细胞的能力
[0042] 为了研宄乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白靶向树突状细胞的能力，我们完 成了融合蛋白与树突状细胞的结合鉴定实验。具体方案为分别用10 μ g/ml的融合蛋白 和乙肝病毒多表位融合多肽与人树突状细胞共孵育，1个小时后，用PBS清洗细胞3次，用 FITC-A标记的HBc抗体与树突状细胞共孵育30分钟，用PBS清洗细胞3次，流式细胞仪 检测，结果显示乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白具有靶向人树突状细胞的能力（图 6) 〇
[0043] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNo.I 所示。
2. 权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因，其特征在于： 核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
3. 含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
4. 含有权利要求3所述重组表达载体的转化菌。
5.权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋 白的编码基因克隆入质粒PET300中，获得重组表达载体pET300-STXB-EP ;将重组表达载体 PET300-STXB-EP转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用终浓度为lmmol/L的异丙基-0 -D-硫代吡喃 半乳糖苷于温度37°C诱导表达4小时，收集菌体，超声破碎，离心取上清，用Ni2+亲和层析 柱纯化，用TEV蛋白酶酶切去除His和Sumo标签，再过葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，即得乙 肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。
6. 权利要求1所述乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白在制备乙肝治疗性疫苗中 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.2所示；该融合蛋白携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281-290、HBcAg98-107、Pol321-330和Pol661-670，还携带有Th表位Padre和志贺毒素，融合蛋白可用于制备乙肝治疗性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。
【IPC分类】C12N15-62, C12N1-21, A61P31-20, C12N15-70, A61K47-48, A61K39-29, C07K19-00
【公开号】CN104744594
【申请号】CN201510190266
【发明人】刘 东, 刘威, 吴玉章
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月21日