一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发育生物学与医药技术交叉领域，具体涉及一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法。
【背景技术】
[0002]据美国心脏协会和我国国家心血管病中心2014年统计数据均表明，心血管疾病是所有致死因素中所占比例最大的疾病(约占40%)，是近年来人类健康的首要威胁。其中先天性心脏病由胚胎期心脏形成和发育缺陷所致，研宄心脏细胞谱系特化与分化过程是探宄其发病机制的重要依据。后天性心脏病主要与生活规律和饮食结构等因素有关，发病后造成数亿心肌细胞迅速死亡，而哺乳动物损失的心肌无法有效的自我修复，最终导致心脏丧失功能。
[0003]斑马鱼是常用的发育和再生研宄的体内模型，特别在心脏发育和再生研宄领域具有诸多优势。首先，斑马鱼胚胎早期分裂迅速，受精后24小时即可形成自发跳动的心脏，而小鼠在第8天，人类为第22天。其次，斑马鱼胚胎通体透明，可大量获取且在体外发育，为筛选心脏发育相关的遗传突变和小分子药物提供了高效的模型。最后，斑马鱼的心脏具有异于哺乳动物的再生能力，斑马鱼心脏的发育和再生研宄有助于筛选和开发治疗心脏病的新药物和新方法。
[0004]目前现有的斑马鱼胚胎筛选诱导心肌细胞形成药物的方法是建立在体内模型上的，是利用斑马鱼整个胚胎筛选影响心肌细胞体内发育的小分子药物(钟涛，用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法，专利公开号:CN102520130A)。由于生物大分子难以穿透细胞膜和胚胎组织、器官等复杂结构，体内筛选模型不适用于筛选影响心肌细胞形成的细胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等物质。此外，体内筛选模型在量化心肌细胞形成表型如心脏大小、心肌细胞数量等方面存在需固定胚胎方向、测量时间长等不便因素，使其难以进行高通量筛选。现虽已建有哺乳动物多能干细胞系分化为心肌细胞的体外模型，但该类方法耗时至少为两周，多能干细胞系长期体外培养和其干性的维持需要较高成本。现有的斑马鱼原代胚胎细胞体外模型是将原肠胚期的胚胎细胞置于含5%胎牛血清的L-15培养液中分化，可用于筛选影响内皮细胞发育和血管发生的药物和因子(HaigenHuang, Anne Lindgren, Xinrong ffu, Ning-Ai Liu, Shou Lin.High-throughput screeningfor b1active molecules using primary cell culture of transgenic zebrafishembryos.Cell Reports, 2012, 2:695-704)。但该方法不能有效的分化出心肌细胞(一个384孔培养板的孔仅有6个表达心肌标记基因的细胞，按该文献中1600个胚胎分离的细胞供一个384孔培养板计算，相当于4.2个胚胎分离的细胞仅能分化出6个表达心肌标记基因的细胞，即I个胚胎得到1.4个心肌细胞)，并且于培养开始后第5天丧失心肌标记基因表达，因此无法有效的用于筛选影响心肌细胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理学测试。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种模式动物斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，通过检测分化后心肌细胞特征基因的转基因荧光标记强度，能够高通量的筛选促进或抑制心肌细胞形成的生物大分子及小分子药物。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]一种斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤:
[0008](I)斑马鱼雌、雄个体交配后收集胚胎，放入水中置于培养箱内培养至囊胚期。
[0009](2)囊胚期的胚胎经次氯酸钠除菌后用E2溶液清洗，再用链霉蛋白酶处理去除绒膜。
[0010](3)去除绒膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎细胞培养液吹打成单个细胞。
[0011](4)离心弃去上清，再用胚胎细胞培养液清洗；
[0012](5)离心弃去上清，加入不含胎牛血清和鱼血清的心肌细胞诱导培养液再悬浮细胞，将细胞悬液加入到明胶包被过的细胞培养容器，置于培养箱内培养，0.5?I小时后加入相应体积比的胎牛血清和鱼血清继续培养，24?48h后即可得到能自发收缩的心肌细胞；所述的心肌细胞诱导培养液的组分和配比如下:Leibovitz L_15培养基40.5% (v/v)、Dulbecco 改良 Eagle 培养基 28.35% (v/v)、Ham，s F12 培养基 12.15% (v/v)、胎牛血清15% (v/v)、鱼血清I % (v/v)、蛋白浓度5mg/mL的斑马鱼胚胎粗提物1% (v/v)、5mg/mL胰岛素 1% (v/v)，青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液 1% (v/v)。
[0013]步骤(I)中使用的斑马鱼可为野生型或其他心脏特征基因标记的转基因斑马鱼如 Tg(cmlc2:EGFP)、Tg(nkx2.5:EGFP)、Tg(cTnT:EGFP)等，荧光标记也可为 DsRed,mCherry、Venus等不同类型和颜色焚光蛋白。
[0014]步骤(I)中斑马鱼雌、雄个体数目的比例优选为1:2。
[0015]步骤(I)中斑马鱼囊胚期胚胎包括1000-细胞期、high、oblong、sphere、dome和30%外包期。
[0016]步骤(2)中所述的次氯酸钠优选浓度为0.003% (w/v)的次氯酸钠，链霉蛋白酶优选浓度为0.001% (w/v)的链霉蛋白酶。
[0017]步骤(2)和(3)中所述的E2溶液的组分和浓度如下:7.5mM NaCl、0.25mM KCl,0.5mM MgS04、0.075mM KH2P04、0.025mM Na2HP04、0.5mM CaCl2,0.35mM NaHCO3，过滤除菌。
[0018]步骤(3)和⑷中所述的胚胎细胞培养液的组分和配比如下-Leibovitz L_15培养基 42% (v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基29.4% (v/v)、Ham’s F12 培养基 12.6% (v/V)、胎牛血清 15% (v/v)、青霉素(10000IU/mL)链霉素(10mg/mL)溶液 1% (v/v)。
[0019]步骤⑷和(5)中所述的离心的条件优选为500g离心5分钟。
[0020]步骤(5)中所述的明胶优选浓度为0.1 %?0.2% (w/v)的明胶。
[0021]步骤(5)中细胞培养容器可为不同规格大小的培养皿、培养瓶以及4孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔培养板。
[0022]步骤(5)中所述的斑马鱼胚胎粗提物优选通过包含如下步骤的方法制备:取受精I?3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，离心取上清，过滤即得斑马鱼胚胎粗提物。更优选的，其通过包含如下步骤的方法制备:取受精后3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，15000g离心30min，取上清，经0.2微米滤器过滤。
[0023]步骤(5)中所述的鱼血清优选通过包含如下步骤的方法制备:选取性成熟前的鲤科鱼类，抽取其血液，静止收集血清，离心取上清，过滤即得鱼血清。更优选的，其通过包含如下步骤的方法制备:选取性成熟前的草鱼、鲫鱼或其他鲤科鱼类，抽取其血液后，37°C静置lh，收集血清，100g离心15min，取上清，经0.2微米滤器过滤。
[0024]步骤(I)和(5)中培养箱内培养的温度优选为26?30°C。
[0025]本发明是将斑马鱼囊胚期原代胚胎细胞置于心肌细胞诱导培养液中体外分化为心肌细胞，仅需24?48小时，每诱导I万个原代胚胎细胞可获得200个以上自发收缩的心肌细胞团(15?25个囊胚期胚胎可提供I万个胚胎细胞用于培养，相当于I个胚胎可得到8.0?13.3个自发收缩的心肌细胞团)，且能保持自发收缩特性20天。本发明方法心肌细胞的诱导分化效率既不过高也不是太低，可适用于促进或抑制心肌细胞形成的因子筛选。基于本方法，通过转基因技术与多功能酶标仪的使用相结合可实现高通量筛选影响心肌细胞形成的生物大分子和小分子药物。本发明不仅快速、经济，且具有更广泛的适用性和更高的筛选效率。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果:
[0027](I)与斑马鱼胚胎的体内筛选模型相比，利用本发明可实现更快速和更高通量的筛选，且筛选的对象范围更广。通过多功能酶标仪10分钟内即可读取一块384-孔培养板内每孔细胞的荧光强度从而得知不同处理的影响，而基于整个胚胎的体内筛选模型则需要对每个胚胎进行观察和分析，单位时间内能分析样本量有限。此外，因生物大分子难以穿透细胞膜和胚胎组织、器官等复杂结构，体内筛选模型仅适用于小分子药物的筛选。而本方法基于体外分化模型，即将胚胎细胞直接暴露在处理条件下，可实现对包括细胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等在内的生物大分子和小分子药物进行筛选。
[0028](2)与哺乳动物心肌细胞体外分化模型相比，本发明的优势在于更经济、更快速得出筛选结果、更接近体内心肌细胞分化的模式。哺乳动物心肌细胞体外分化模型涉及多能干细胞系的长期培养和维持，需要购买多种维持干性的抑制因子，大幅度提高了筛选成本。此外哺乳动物心肌细胞体外分化需要至少两周时间。本发明利用斑马鱼胚胎易于大量获取的优势，使用原代胚胎细胞进行向心肌细胞的分化，无需长期体外培养和维持胚胎细胞的多能性，且在24至48小时即可形成自发收缩的心肌细胞。
[0029](3)与现有的斑马鱼胚胎细胞体外分化方法相比，本发明的优势在于诱导效率更高且心肌细胞特征维持时间更长。现有的斑马鱼胚胎细胞体外分化方法中分离I个胚胎中的细胞仅能得到1.4个心肌细胞，且其心肌细胞特征仅能维持5天，无法有效的用于筛选影响心肌细胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理学测试。本方法中分离I个胚胎中的细胞可得到8.0?13.3个心肌细胞团，其心肌细胞特征可维持长达20天。本方法的心肌细胞诱导分化效率既不过高、也不过低，促进和抑制因子的筛选均可适用。
【附图说明】
[0030]图1是Tg(cmlc2:EGFP)转基因斑马鱼胚胎细胞分化后2天(A)、4天(B、C)、7天(D)和14天(E)的能自发跳动的GFP阳性心肌细胞形态图。(A-E)为明场观察，(A’ -E’ )为488nm激发光下的暗场观察，原始放大倍数20 X。
[0031]图2是体外分化不同天数的心肌细胞自发跳动频率箱线图。每个时间点记录的跳动细胞团数目为100?120个。
[0032]图3是添加胰岛素对斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的影响结果图。(A)未添加胰岛素(INS_)和添加胰岛素(INS+)对Tg(cmlc2:EGFP)转基因胚胎细胞分化为GFP阳性心肌细胞的效果对比，原始放大倍数