葡萄糖异构酶、基因、突变体、工程菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及葡萄糖异构酶基因、突变体，和产葡萄糖异构酶基因工程菌及其构建 方法和应用，属于基因工程领域。 (二） 技术背景
[0002] 葡萄糖异构酶（Glucoseisomerase，简称GI，EC5. 3. 1. 5)，又称木糖异构酶 (Xyloseisomerase，XI)，能够催化D-葡萄糖和D-木糖的异构化反应，分别转化为D-果糖 和D-木酮糖，是食品工业领域重要的生物催化剂之一，尤其是在生物转化制备高果糖浆的 工艺中具有关键的作用。
[0003] 高果糖浆（HFCS)是葡萄糖和果糖混合物，也称果葡糖浆，是一种重要的甜味剂。 根据果糖的含量，高果糖浆可分为三种类型，HFCS-42(果糖42%、葡萄糖53%、多聚糖 5% )、HFCS-55(果糖55%、葡萄糖42%、多聚糖3% )和HFCS-90(果糖90%，葡萄糖9%， 多聚糖1% )。HFCS-90主要是通过HFCS-42分离、浓缩、纯化制得，直接作为添加剂使用较 少，一般用于制备HFCS-55。HFCS-55 -般是由HFCS-90与HFCS-42混合制成。自从上世纪 六十年代作为一种甜味剂被应用于食品领域，高果糖浆的市场需求逐年增加，探索其工业 化生产的方法也层出不穷。目前制备高果糖浆的方法主要有化学法、发酵法和酶法。其中 应用葡萄糖异构酶生物转化法生产的HFCS-42是目前市场上高果糖浆的主要来源。
[0004] 葡萄糖异构酶催化D-葡萄糖异构化是一个热力学平衡反应。葡萄糖异构酶（第 一类GI) -般在高于60°C左右时催化活性降低，转化率最高达到42~45%，因此，只能用 来制得HFCS-42。若能筛选到耐高温的葡萄糖异构酶（第二类GI)，可将反应温度提高至 85°C以上，促进D-葡萄糖向D-果糖的转化，从而提高转化率至55%以上，因此可以直接生 产HFCS-55。
[0005] 目前已经有一些耐高温葡萄糖异构酶的报道，例如来自于阿波罗栖热袍菌 ThermotoganeapolitanaDSM5068和海栖热袍菌ThermotogamaritimeDSM3109 的葡萄 糖异构酶，其最适反应温度分别达到了 97°C和105°C。然而，有些耐高温的葡萄糖异构酶耐 酸能力较弱，在碱性条件下会催化生成有色物质阿洛酮糖。目前商业化生产的葡萄糖异构 酶难以满足HFCS-55生产的需求。因此筛选出新型的表达耐高温的葡萄糖异构酶基因，并 通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在HFCS-55的制备中具有重要的意义。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种葡萄糖异构酶、编码基因、重组载体、基因工程菌及其突变 体，以及葡萄糖异构酶基因工程菌在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应用，本发明提 供的通过重组大肠杆菌高效表达的耐高温葡萄糖异构酶，解决了一般的葡萄糖异构酶最适 反应温度低的问题，同时经过突变改造后的葡萄糖异构酶突变体能使D-葡萄糖的转化率 达到55. 4%，为高果糖浆（HFCS-55)的大规模生产提供了良好的技术支持。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明涉及一种葡萄糖异构酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明涉及一种葡萄糖异构酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0010] 本发明还涉及一种含所述葡萄糖异构酶基因的重组载体，由所述重组载体构建的 重组基因工程菌。
[0011] 本发明还提供一种所述葡萄糖异构酶编码基因在制备葡萄糖异构酶中的应用，所 述的应用为：构建含有所述葡萄糖异构酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆 菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，取培养液分离得到含葡萄糖异构酶的菌体细 胞。
[0012] 本发明涉及一种所述葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中的应 用，所述的应用为：以含葡萄糖异构酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源， 以D-葡萄糖为底物，以镁盐和钴盐为助剂，以去离子水为反应介质，在55~100°C(优 选80~95°C，最优选90°C)、150r/min条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得 D-果糖；所述底物初始浓度为50~500g/L去离子水，湿菌体的质量用量为20g/L去离子 水，所述镁盐终浓度为5~25mmol/L去离子水，钴盐终浓度为0. 1~5mmol/L去离子水。进 一步，优选所述底物初始浓度为l〇〇g/L去离子水，湿菌体的质量用量为20g/L去离子水，所 述镁盐和钴盐在反应体系中物质的量终浓度分别为15mmol/L去离子水和lmmol/L去离子 水。
[0013] 本发明葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中所用酶源的制备方法 为：将含萄萄糖异构酶基因的重组基因工程菌接种至含终浓度40yg/mL卡那霉素的LB液 体培养基，37°C、150r/min培养至0D_= 0. 8~1. 0,获得种子液；将种子液以体积浓度2% 的接种量转入含终浓度40yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、150r/min条件下 培养006(|(|=0.4~0.8，添加终浓度0.511111?了6,281：、1501'/111111诱导培养1011，获得诱导 培养液，将诱导培养液离心，收集湿菌体，即为酶源。
[0014] 此外，本发明还提供一种葡萄糖异构酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列的139位和/或186位氨基酸进行单突变或双突变获得的，具体优选所述突变 体为下列之一 ：（1)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第139位的色氨酸突变为苯丙氨酸，氨 基酸序列为SEQIDNO. 7所示，核苷酸序列为SEQIDNO. 3所示；（2)将SEQIDNO. 2所示 氨基酸序列第186位的缬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 8所示，核苷酸序列 为SEQIDNO. 4所示；（3)将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列第186位的缬氨酸突变为苏氨 酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 9所示，核苷酸序列为SEQIDNO. 5所示；（4)将SEQIDNO. 2 所示氨基酸序列第139位的色氨酸突变为苯丙氨酸，同时将SEQIDNO. 2所示氨基酸序列 第186位的缬氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO. 10所示，核苷酸序列为SEQID NO. 6所示。
[0015]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO. 1，SEQIDNO. 3,SEQIDNO. 4,SEQID NO. 5,SEQIDNO. 6所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属 于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核 苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺 失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能 是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
[0016] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO. 2,SEQIDNO. 7,SEQIDNO. 8， SEQIDNO. 9,SEQIDNO. 10所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物 活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上， 均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或 替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性 质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0017] 本发明涉及所述葡萄糖异构酶突变体编码基因，编码基因构建的重组载体以及重 组载体转化制备的重组基因工程菌。
[0018] 本发明涉及一种所述葡萄糖异构酶突变体在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖 中的应用，所述的应用为：以含葡萄糖异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培 养获得的湿菌体为酶源，以D-葡萄糖为底物，以镁盐和钴盐为助剂，以去离子水为反应介 质，在50-100°C(优选90°C)、150r/min条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得 D-果糖；所述镁盐终浓度为5~25mmol/L去离子水（优选15mmol/L)，钴盐终浓度为0. 1~ 5mmol/L去离子水（优选2mmol/L)。进一步，在优选条件下，反应5h，转化率高于55%，反 应在1.5h趋于平衡。
[0019] 进一步，所述葡萄糖异构酶突变体在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中所用酶 源按如下步骤制备：将含萄萄糖异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度 40yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C、150r/min培养至0D6QQ=0. 8~1. 0,获得种子 液；将种子液以体积浓度2%的接种量转入含终浓度40 y g/mL卡那霉素的LB液体培养基 中，于37°C、150r/min条件下培养 0D6QQ= 0?4~0?8,添加终浓度 0?5mM IPTG，28