一种磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种磁性纳米材料固定化阿魏酸醋酶的方法。
【背景技术】
[0002]阿魏酸酯酶又称为肉桂酸酯酶，属于羧酸酯酶的亚类，来源于真菌、细菌和酵母，可以水解交联在半纤维素间及半纤维素与木质素之间的阿魏酸酯键，如低聚阿魏酸酯、阿魏酸甲酯和多糖阿魏酸酯酶中的酯键，在木质纤维的降解中起着重要的作用，如促进半纤维素、木素与纤维素的分离等，有利于纤维素的进一步利用，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。
[0003]然而，阿魏酸酯酶价格昂贵，且工业生产使用阿魏酸酯酶都是一次投放，无法回收，造成不必要的浪费。如果能将阿魏酸酯酶固定化在某种合适的载体上，并且固定化阿魏酸酯酶保持很高的活性，那么这将对工业生产带来极大的价值。自20世纪60年代以来，固定化酶的研宄取得了长足的发展。在实际应用上，由于固定化酶克服了水相反应中酶无法回收利用的缺点，从而使生产工艺易于实现自动化、连续化，提高了酶的利用效率，并且在节约能源、开发和利用自然资源及免除公害方面有着巨大潜力。目前也有少量报道关于阿魏酸酯酶的固定化，如利用介孔硅固定化阿魏酸酯酶来提高酯基转化量等。研宄焦点主要就是固定化载体的设计、制备和选用。人们习惯运用天然物质或一些高分子单体作为载体，在分离时需要采用重力沉降、过滤、抽滤，甚至离心等，工艺流程长，费时费力，不利于工业实际运用。
[0004]磁性纳米材料作为固定化载体有着很大优势，纳米材料本身具有较大的比表面积，易于固定酶，提高酶的固定量，而且磁性纳米材料所具有的磁性可以使固定化酶易于从反应体系中分离出来，便于重复使用。中国专利公开号CN102649954A公开了一种磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法，以磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料作为载体，采用共价偶联法固定糖化酶，此方法虽可实现糖化酶的再生，但固定化酶合成工艺复杂，反应条件苛刻，且再生后的糖化酶使用数次后完全失活，再生效果不理想。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种高酶活的磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法，克服现有的阿魏酸酯酶价格昂贵不能重复利用等难题。采用该方法阿魏酸酯酶固定后，仍然保持较高的酶活，方便重复利用，降低生产成本，提高经济效益。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法，其特殊之处在于:包括以下步骤:
(I)将FeCl3.6H20和FeSO4.7H20溶于去氧蒸馏水中，氮气保护下搅拌，待混合物完全溶解后加入氨水，快速搅拌30min，将反应体系放在梯度磁场中静置，黑色物质沉于底部，得到Fe3O4磁性纳米材料，将Fe 304磁性纳米材料用去氧蒸馏水洗涤5_6次，调pH至2.5-3.0，加热氧化，得到Fe2O3固定化载体磁性纳米材料；
(2 )将固定化载体磁性纳米材料与用缓冲液配置的阿魏酸酯酶溶液混合，磁性纳米材料与阿魏酸酯酶的质量比为0.01-0.2，调整混合溶液的pH至4-11，温度为20-60°C，轻摇振荡 2-12h ；
(3)将混合液放置在磁力设备上静置处理，上清液用于酶蛋白测定，沉淀物用去离子水洗涤数次，直至上清液中没有游离酶为止，获得固定化阿魏酸酯酶，4°C保存备用。
[0007]本发明的磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法，步骤(2)中所述的固定化载体磁性纳米材料颗粒直径为10-40nm。
[0008]本发明的磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法，步骤(2)中所述阿魏酸酯酶溶液的浓度为0.5-2mg/mL, pH为6_8。
[0009]本发明的磁性纳米材料固定化阿魏酸酯酶的方法，步骤(2)中阿魏酸酯酶与磁性纳米材料的质量比为0.0125-0.125，pH为4-9，温度为20-50 °C。
[0010]本发明与现有技术相比具有以下优越性:(1)载体制备工艺简单，成本低廉；载体比表面积大，有利于酶的固定和固定后的稳定性；载体的磁性可以使固定化酶在外加磁场下分离下来，易于酶的重复利用。(2)固定工艺简单，操作条件温和，不需要昂贵设备；(3)固定后阿魏酸酯酶酶活仍然保持等量游离酶活的90%以上，且热稳定性提高，在40°C恒温下120h，游离阿魏酸酯酶酶活仅保存45%，而本发明固定化阿魏酸酯酶的酶活能保存80%以上。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均可商业获得。
[0012]实施例1
固定化阿魏酸酯酶降解阿魏酸对硝基苯酚酯:
阿魏酸对硝基苯酚酯被阿魏酸酯酶或者固定化阿魏酸酯酶降解为对硝基苯酚，对硝基苯酚在410 nm处有较强的特征吸收，可以采用紫外可见分光光度计进行检测。阿魏酸对硝基苯酚酯是设计的模拟底物，为非商品化化合物，以阿魏酸和对硝基苯酚为原料，一步法合成阿魏酸对硝基苯酚酯，在热水中对产物进行4次重结晶纯化。
[0013]缓冲溶液配置:分别取68.5mL 0.lmol/L NaH2POjP 31.5mL 0.lmol/L Na2HPO4，混匀后再加入2.5mL的Triton X_100，摇匀，溶解后放置使用。
[0014]10 mmol/L的阿魏酸对硝基苯酚酯(或对硝基苯酚)的二甲亚楓(DMSO)溶液的配制:称取0.1 mmol的阿魏酸对硝基苯酚酯(或对硝基苯酚；其中阿魏酸对硝基苯酚31.5mg或对硝基苯酚13.9mg)置于1mL容量瓶中，再定容至刻度，摇匀。
[0015]将商品阿魏酸酯酶稀释至不同倍数:取50yL的阿魏酸酯酶商品酶液，加入450 μ L 的含有 2.5% (V/V)的 Triton X-100 的 0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 6.5)-稀释10倍，按该方法逐步稀释至500倍，1000倍，1500倍，2000倍，测定其酶活。
[0016]酶活定义:20°C，pH6.5，每分钟降解阿魏酸对硝基苯酚酯生成I μ mo I对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
[0017]测定方法:反应体系为I mL，其组成为:100 yL 10 mmol/L的阿魏酸对硝基苯酚酯的DMSO溶液，800 μ L含有2.5% (V/V)的Triton Χ-100的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH
6.5)和100 μ L的酶溶液。在室温(约20°C )下混合后，取100 μ L反应液润湿比色皿后倒掉，将剩余900 μ L倒入比色皿中，等410 nm波长处吸收值不再下降后开始计时并记下读数