一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因缺失失活技术领域，具体涉及一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的 核糖核酸分子，可用于罗氏沼虾雄性生殖相关的RNA干扰研宄。
【背景技术】
[0002]RNA干扰（RNAinterference,RNAi)技术作为一种基因功能研宄的重要手段，已 被广泛用于探索虾蟹动物的基因功能领域。RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭 特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能领域。
[0003] 目前，RNA干扰技术主要是利用小干扰RNA(siRNA)来实现基因沉默，其制备方法 主要有化学合成，体外转录和体内表达三种，各有利弊。化学合成方法能制备高质量的RNA 干扰样品，但价格高，定制周期长；体外转录方法合成，成本相对较低，但实验的规模和量受 到限制，不适用于样品需求量大的长期研宄；体内表达主要指采用siRNA表达载体和基于 PCR的表达框架，可以进行较长期研宄，但只适用于细胞水平。
[0004] 虾蟹动物作为一种重要的经济甲壳动物，其功能基因的发掘和应用研宄进展较 慢，主要原因之一是缺乏可用于长期动物实验研宄所需的、具有高效基因沉默效果的RNA 干扰样品。目前，常用的小干扰RNA在动物实验时难以维持长效的干扰效率，而且动物实验 所需RNA用量大，合成成本过高。因此，在探索虾蟹动物基因功能领域中，快速而高效地制 备大量的双链RNA样品，是开展长期动物实验研宄的重要前提和基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子及其制备 方法，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，包含有：
[0007] 1)核苷酸序列为SEQIDNO: 1的核酸分子
[0008]Tgtttgctggttttgatgaaaaaaggaatcgtcattcttgagatctggagagcgagattagcaacagag gtcactgcgaataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtct ctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacga atgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcga ctctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaat tcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagctgctgtgcttcagtaatggcgaccacagggtccaatc aggagaatgacccagattcacagtttggacatgatagcggataagaaatatggtactgatttgttaaaaagcataga atgagctgaattcaatttaaagaaaggattttactacttttactaataagtaaagcgcctgtttctcgacaataaac atcatcacgataggagttaaagaaacatttatgtaaattaggaaataaatcaattcacttaataaaaaaaaaaaa；
[0009] 2)与1)中的核酸分子具有85%以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。
[0010] 上述2)中的同源性，优选为90%以上；
[0011] 上述核苷酸分子编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQIDN02 ;
[0012] MAPFFKLISVMVMVAMGFILVSEAASDLQDAAMHDYPTVLEIIGSPRMKRSPHKAESGFYGSNRGMEAD FFGDSGTYSTGYGLGGLSRLTGKFSGEGEFAGGAHSGRFYD.
[0013] 为了提高RNAi的效率，申请人对序列为SEQIDNO: 1的核酸分子进行了优化选 择，在不改变编码蛋白序列的情况下，主要选取目的基因开放阅读框区域，包含338个核苷 酸组成的基因片段序列，改造后的核酸分子的序列为SEQIDN0:3;
[0014]ataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctct gaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaat gaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgact ctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattc gctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagc
[0015] 上述的核苷酸分子用于制成双链RNA样品，可实现高效干扰效率，从而干扰罗氏 沼虾雄性生殖发育；
[0016] 本发明还提供把上述核苷酸分子制成双链RNA的方法，包括有如下的步骤：
[0017] 1)目的核酸片段的扩增：
[0018] 以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的核 苷酸片段，其中扩增所用的引物序列如下：
[0019]正向引物（ForwardPrimer，FR)序列为：
[0020] 5 '-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3'，下划线标注核苷酸为Xbal限制性核酸 内切酶的识别位点；
[0021] 反向引物（ReversePrimer，RP)序列为
[0022] 5 ' -CGGGATCCGCTCAATCATAAAAACGTCC-3 '，下划线标注核苷酸为BamHI限制性核酸 内切酶的识别位点；扩增得到目的基因的核苷酸片段两端分别含有限制性核苷酸内切酶的 识别位点；
[0023] 2)连接转化
[0024] 利用限制性核酸内切酶，对目的核苷酸片段和双链表达质粒分别进行双酶切。将 酶切后的目的片段和质粒进行连接，制备获得含有目的核苷酸片段的重组质粒。将该重组 质粒转入到大肠杆菌的感受态细胞E.coliDH5a中，鉴定并挑选出含有正确插入序列的单 菌落，-80度保存菌种。
[0025] 3)双链RNA的诱导表达
[0026] 从大肠杆菌中抽提出含有目的插入序列的载体，并将其转入到表达型大