一种高温木聚糖酶和一种高温木糖苷酶的基因及其蛋白表达和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和生物质利用领域，具体涉及一种高温木聚糖酶基因和一种 高温木糖苷酶基因及其蛋白表达与应用。
【背景技术】：
[0002] 半纤维素是自然界中数量最大、最重要的可再生利用的生物质之一。木聚糖是半 纤维素中最主要的组分。木聚糖结构复杂，主链由通过0-1，4-糖苷键连接的吡喃木糖 组成，并包含葡萄糖醛酸基、乙酰基，a-L-呋喃型阿拉伯糖基等侧链。木聚糖及其酶解产 物在食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域具有广泛应用价值（M.P〇lizeli，A. Rizzatti，R.Montietal.2005)。尽管天然木聚糖的酶解得到广泛的重视，但酶协同作用 低、稳定性差等因素仍然限制了其应用。本发明涉及的高温厌氧菌C.owensensis0L能够 在高温环境下高效利用天然半纤维素为碳源（S.Blumer-Schuette,D.Lewis,R.Kellyet al. 2010)。本发明从C.owensensis0L中获得0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶基因， 并在进行大量重组表达。0 -1，4-木聚糖酶能够具有在高温条件下（75°C)将天然半纤维素 转化低聚木糖，0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶能够协同作用将天然木聚糖完全转 化成木糖。
【发明内容】
[0003] 发明目的：
[0004] 本发明的目的是弥补现有木聚糖降解技术的不足，提供一种高温木聚糖酶和一种 高温木糖苷酶的基因，包含基因的重组载体和重组工程菌，以及两种酶的蛋白表达和应用。 具体包括如下：
[0005] 1、一种高温P-1，4-木聚糖酶CoXylanaseA的基因，其基因序列如SEQIDNO. 1 所不，其表达的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 2所不。
[0006] 2、一种高温@-1，4-木糖苷酶(：〇乂71〇81(1&86 4的基因，其基因序列如5￡0 10 NO. 3所不，其表达的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 4所不。
[0007] 3、本发明提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体pET-28b-XylanaSeA和包含上 述木糖苷酶基因的重组载体pET-28b-XylosidaseA。
[0008] 4、本发明提供包含上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A基 因及重组载体的重组菌，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)。
[0009] 5、本发明提供制备上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A表 达和纯化的方法。
[0010]6、本发明提供上述高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A在 酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的单独和协同应用，优选其在水解榉木木聚糖及其在 制备低聚木糖和木糖中的应用。
[0011] 技术方案：
[0012] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0013] (1)高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA基因重组载体和 重组工程菌的构建。
[0014] 提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增木聚糖酶Co XylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的基因，再酶切连接到载体pET_28b上，转化大肠 杆菌ToplO感受态细胞，筛选并通过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠 杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，获得还有重组载体的重组工程菌。
[0015] (2)上述高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的蛋白纯化 和酶学活性测定。
[0016]将获得的重组工程菌转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高 速离心和Ni-NTAs印harose4B亲和层析分离纯化；然后通过SDS-PAGE电泳和分子筛鉴定 蛋白分子大小和聚合态，其中高温木聚糖酶CoXylanaseA以单体形式存在，高温木糖苷酶 CoXylosidaseA存在单体和聚体形式；最后浓缩，测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。
[0017] (3)上述高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA对天然木聚 糖的应用。
[0018] 称取并配制天然榉木木聚糖溶液，将溶液分为四组，一组为对照，一组加高温木聚 糖酶Co Xylanase A，一组加高温木糖苷酶Co Xylosidase A，一组合用上述两种酶，分别在 最适温度和最适pH范围内作用，然后取反应液，用薄层层析法定性分析天然木聚糖水解后 成分，并用对羟基苯甲酸酰肼（P_hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH)法测定还原糖 含量。有益效果：为克服现有技术的不足，本发明从高温噬厌氧菌C. owensensis的基因组 中获得一种高温木聚糖酶Co Xylanase A和一种高温木糖苷酶Co Xylosidase A的基因，并 通过克隆表达获得相关酶蛋白。高温木聚糖酶Co Xylanase A最适温度为75°C，在55-85°C 范围内保持较高活性，最适pH值为7. 0,在pH5. 5-8. 5范围内保持较高活性。高温木糖苷酶 Co Xylosidase A最适温度为75°C，在60-85°C范围内保持较高活性，最适pH值为5.0,在 pH4. 5-6. 0范围内保持较高活性。实验证明高温木聚糖Co Xylanase A能将天然木聚糖有 效降解为低聚木糖和少量木糖，而联合使用高温木糖苷酶Co Xylosidase A能显著提高木 糖含量。两种酶的单独或联合作用具有潜在的工业应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1 :高温木聚糖酶CoXylanaseA和高温木糖苷酶CoXylosidaseA表达的 SDS-PAGE分析
[0020] 其中：A高温木聚糖酶CoXylanaseA表达的SDS-PAGE分析（M为蛋白分子量标 准）
[0021]B高温木糖苷酶CoXylosidaseA表达的SDS-PAGE分析(M为蛋白分子量标准）
[0022] 图2:高温木聚糖酶Co Xylanase A和高温木糖苷酶Co Xylosidase A的 Superdex200层析和SDS-PAGE电泳图
[0023] 其中：A高温木聚糖酶CoXylanaseA
[0024]B高温木糖苷酶CoXylosidaseA
[0025] 图3 :温度和pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响
[0026] 其中：A为温度对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响
[0027]B为pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响
[0028] 图4 :温度和pH对高温木糖苷酶CoXylosidaseA活性的影响
[0029] 其中：A为温度对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响
[0030]B为pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响
[0031] 图5:高温木聚糖酶Co Xylanase A和高温木糖苷酶Co Xylosidase A协同酶解 榉木木聚糖的薄层层析
[0032]其中：1 标样（Xylose:Xl;Xylobiose:X2;Xylotriose:X3;Xylotetraose:X4) ;2 棒 木木聚
[0033] 糖；3棒木木聚糖+CoXylanaseA;4棒木木聚糖+CoXylosidaseA;5棒木木聚 糖
[0034]+CoXylanaseA+CoXylosidaseA)
【具体实施方式】
[0035] 实施例1 :高温木聚糖酶CoXylanaseA和高温木糖苷酶CoXylosidaseA重组 工程菌株的构建
[0036] 细菌基因组DNA的提取：
[0037] 在75°C，厌氧环境下培养C.owensensis菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培 养细菌的基因组DNA，-20°C冻存备用。
[0038]PCR引物设计：
[0039] 根据公开的C.owensensis基因组序列信息，预测木聚糖酶和木糖苷酶的基因，设 计克隆所用的PCR引物。其中用于扩增高温木聚糖酶CoXylanaseA基因的引物如下：
[0040]MI13003 5' -GGAATTCCATATGAGTGAATATCAAGATAAAAC-3'
[0041]MI13004 5' -CCGCTCGAGTTAAAAATTAACAATCCTGAAAAATG-3'
[0042] 用于扩增高温木糖苷酶CoXylosidaseA基因的引物如下：
[0043]MI13017 5' -GCCGCGCGGCAGCATGAAAATAGAACTTTAC-3'
[0044]MI13018 5' -GCGGCCGCAAGCGTTTACTCAGTTTTTATCG-3'
[0045] 用于连接CoXylosidaseA基因的载体引物如下：
[0046]pET-28b-vector-F5，-CGCTTGCGGCCGCACTCG-3'
[0047]pET-28b-vector-R5' -TGCTGCCGCGCGGCACCA-3'
[0048] 从基因组DNA中PCR扩增基因：
[0049] 以C.owensensis基因组DNA为模板，引用设计引物进行PCR扩增CoXylanaseA 基因和CoXylosidaseA基因，琼脂糖凝胶电泳检测确认扩增DNA片段，用普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收PCR产物。
[0050] 高温木聚糖酶CoXylosidaseA基因的酶切与连接：
[0051] 高温木聚糖酶CoXylosidaseA基因DNA片段和质粒pET_2