一种利用热凝胶发酵液直接生产β-1,3-葡寡糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用热凝胶发酵液直接生产β -1, 3-葡寡糖的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]β_1，3-葡寡糖是一类具有重要功能的生物活性物质。其具有的生物功能为:(I)促进肠道有益菌群的生长。(2)调节机体免疫反应。抗生素的广泛使用提高了病原菌对抗原的抵御能力，功能性β_1，3-葡寡糖能够作为抗原的增强剂提高免疫原性。(3)抵抗肿瘤。β -1, 3-葡寡糖在增强巨噬细胞活性，对肿瘤细胞产生细胞毒性的同时，还能够使其产生肿瘤坏死因子(TNF-α )、白介素-1 (IL-1)和干扰素(IFN-a )等，从而抵抗肿瘤。(4)诱导植物抵御病害。β -1, 3-葡寡糖能够激发一系列信号反应，从而促进防御蛋白和植物抗毒素的合成，从而抵御致病菌的入侵。目前报道的能够响应β-1，3-葡寡糖激发子并产生抗生素的植物有大豆、葡萄、水稻、小麦、烟草和拟南芥等。
[0003]目前β-1，3_匍寡糖的制备方法主要包括以下二种:直接提取法、人工合成法和多糖水解法。直接提取法包括水提法、有机溶剂萃取法和微波提取法等。通过不同的方法抽提后通常需要除去其中的蛋白质和脂肪等大分子物质，然后经脱色、除盐、浓缩和干燥等步骤得到寡糖粗品。人工合成法包括酶法合成、化学合成法和微波合成法。酶法合成过程中用于寡糖合成的酶主要有糖苷转移酶、糖基水解酶和糖基合成酶等。丰富的原料来源是多糖水解法制备寡糖的最显著优势。多糖水解法包括酸水解法和酶水解法。水解常用的酸试剂有HCl、TFA和H2SO4等。自然界中有多种微生物可以生产β-1，3-葡聚糖内切酶，主要分为以下两类:细菌和真菌。细菌中以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌{Bacillus
、地衣芽孢杆菌{Bacillus Iicheniformis)等；真菌中以霉菌为主，主要有康氏木霉{Trichoderma、里氏木霉{Trichoderma /"eesei)、绿色木霉{Trichoderma
viride)和哈茨木霉{Trichoderma harzianum)等。
[0004]β-1，3-葡聚糖是由β-1，3-糖苷键连接而成的带有不同分支的多糖。多糖水解法采用的制备原料主要有海带多糖、裂褶多糖、香菇多糖、茯苓多糖和热凝胶等，除热凝胶夕卜，其他多糖都带有不同程度的β_1，6-糖苷键分支。与其他多糖相比，热凝胶分子结构相对简单，不带β -1，6-糖苷键分支，可通过微生物发酵法大量获得，具有纯度较高，价格低廉等特点。利用热凝胶水解制备β-1，3-葡寡糖，可有效避免其他原料中杂质的去除工艺步骤及其带来的环境污染，大大降低寡糖生产成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用热凝胶发酵液直接生产β -1, 3-葡寡糖的方法，以获得β _1, 3-匍寡糖粗制品。
[0006]本发明的技术方案:先利用土壤杆菌ATCC 31749通风发酵获得热凝胶发酵液(Applied B1chemistry and Microb1logy, 2014，50 (I): 35 - 42)，加入 lOmol/L 的 NaOH溶液，使热凝胶发酵液的pH升至9~12，加热升温至40~55°C，搅拌混合30~50 min，使土壤杆菌死亡，再用12 mol/L的浓HCl调节pH至偏酸性(pH为5~7)。处理后的热凝胶发酵液作为培养哈茨木霉的培养基组分之一，添加经高温灭菌(121°C，30min)处理后的浓缩氮源溶液，添加比例为基础配方体积的10%~20% (V/V)，浓缩氮源溶液的组成为胰蛋白胨10%~20%(ff/V)，NaNO3 5%~10%(ff/V), pH 为 5~7，以纯净水配制。接种 Trichoderma harzianum RifaiACCC 30371 (食品工业科技，2014，35 (12): 157-161)进行通风发酵，接种体积为5%~15%(V/V)，通风条件为0.5-1.0 vvm,变速调整搅拌转速使溶氧值达到30%以上，发酵温度为25~32°C，发酵时间为3~5d，获得富含β-1，3-葡聚糖内切酶的哈茨木霉发酵液。未经灭活处理的新鲜热凝胶发酵液再与该哈茨木霉发酵液按一定体积比(10~20:1，V/V)混合，利用β -1, 3-葡聚糖内切酶进行水解反应，反应温度为40~60°C，反应pH为4.0-6.5，反应2~3h后得到富含β -1, 3-葡寡糖的混合液，反应结束后再加热反应液温度至70~90°C，维持20~40min使酶失活。所得的混合物再经离心或过滤分离操作，离心工艺为3000~8000 r/min, 10-20 min,收集上清液。固液分离过程也可以采用板框过滤工艺，滤布孔径为200~400目，过滤压力为0.2-0.8MPa，收集滤液。最后进行浓缩和干燥，获得β -1, 3-匍寡糖粗制品，浓缩和干燥温度不超过110°C。
[0007]本发明的有益效果:目前利用β-1，3-葡聚糖生物水解法制备β-1，3_葡寡糖的生产工艺多采用纯化后的β_1，3-葡聚糖。以商品化的粉末状热凝胶、海带多糖、裂褶多糖、香菇多糖、茯苓多糖等为出发原料，重新溶解或水化后，再加入经初步分离纯化后的商品化β-1，3-葡聚糖内切酶溶液，生产工艺更复杂，操作步骤多，底物转化率较低，特别是以热凝胶为底物时，由于热凝胶是不溶于水的多糖，商品化的热凝胶由于经过了干燥处理，易形成不可逆的三螺旋结构，不仅不溶于水，水化过程也很困难，在水解过程中热凝胶颗粒具有双层结构:即一部分热凝胶分子以水化胶体形式包裹在致密的不溶性内核外围，其外围部分易被水解，但其内核部分则很难被水解，导致底物转化率显著下降(AppliedMicrob1logy and B1technology, 2013, 97: 8495 - 8503)。本发明工艺直接米用新鲜的热凝胶发酵液，热凝胶颗粒不会形成核壳型双层结构，底物可被彻底水解，底物转化率高。与此同时，以热凝胶发酵液为哈茨木霉通风发酵的主要原料之一，热凝胶既是哈茨木霉生长的碳源物质，又是β-1，3-葡聚糖内切酶生物合成的诱导剂，有利于高效合成β _1，3-匍聚糖内切酶，最终有利于尚效制备β _1，3-匍寡糖。本发明方法直接利用热凝月父发酵液作为酶水解底物和哈茨木霉发酵生产β -1, 3-葡聚糖内切酶的碳源和诱导剂，显著减少了 β -1, 3-葡寡糖制备的操作单元数，既提高了产品生产效率，又减少了生产过程中三废排放和能耗，有益效果明显。
【附图说明】
[0008]图1 β -1，3-葡寡糖粗制品生产工艺流程示意图。
【具体实施方式】
[0009]实施例1:热凝胶发酵液热碱灭活工艺利用土壤杆菌ATCC 31749通风发酵获得热凝胶发酵液，发酵方法同参考文献(Applied B1chemistry and Microb1logy, 2014，50 (I): 35 - 42)。种子培养基配方为(g/L):葡萄糖20，酵母粉10,KH2PO4 1.74,MgSO