一种检测食树脂新鞘氨醇菌的引物及定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物 及定量检测方法，属于生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 多环芳径（Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs)是指分子中含有两个 或两个以上苯环的烃类，具有普遍的细胞毒性、致畸性以及致癌性。由于其化学结构的稳定 性以及极强的疏水性，决定了这类化合物在环境中能够长期稳定存在，难以用常规方法治 理。随着工业科技的发展，大量的PAHs进入环境，这些PAHs极可能通过食物链的富集作用 危害人类的健康。而利用微生物降解多环芳烃（PAHs)等持久性有机污染物的研宄已成为 当今环境科学的一个发展方向。
[0003] 食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)属于新鞘氨醇杆菌属 (Novosphingobium sp.)，新鞘氨醇杆菌属是环境中比较独特的一类新型的微生物资源，具 有降解芳烃等污染物的特性，是优良的芳烃污染环境修复菌。该菌属的降解范围非常宽，从 单环、多环芳烃到其它有机污染物都可以作为它们生长的碳源。由于这类降解菌既具有广 泛的底物范围，又具有很高的降解率，所以应用到生物修复当中具有较大潜力。
[0004] 目前，对于环境中食树脂新鞘氨醇菌的检测方法主要是依赖分离培养加分子鉴 定，这种方法计数周期长、工作量大、检测数量不准确等，因而限制了食树脂新鞘氨醇菌在 修复环境问题中的进一步研宄应用。因此，迫切需要一种快速定量测定环境中食树脂新鞘 氨醇菌检测方法。以为该菌的在环境中应用提供理论依据及技术支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种检测食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物及定量检测方法。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] -种检测食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物，所述引物 为一对，分别为正向引物SEQ ID NO. 1和反向引物SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0008]
[0009] 反向引物 NR 序列 NR:5' -CACCTGTGCACGGTCCAGCC-3' ；SEQ ID NO. 2
[0010] -种食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的定量检测方法，其特 征在于，步骤如下：
[0011] (1)提取食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的基因组DNA，得基 因组DNA溶液；
[0012] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，经纯化后， 与载体连接后转化感受态细胞DH5 a，涂含氨苄抗生素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行 扩大培养，提取质粒，经验证后，制得标准检测溶液原液，经紫外分光光度计测定浓度并换 算拷贝数，换算公式：
[0013] DNA 拷贝数（copies/y 1) = (6.02X 1023) X (DNA 浓度（ng/yL) X1(T9V(DNA 长 度 X660)
[0014] (3)将步骤⑵制得的标准检测溶液原液按照10倍梯度稀释，获得不同浓度的稀 释液，以获得的稀释液为扩增模板，通过定量PCR扩增，得到扩增标准曲线如下：
[0015] y = -3. 4591og (x)+43. 197 ；
[0016] 其中，y为Ct值，x为质粒DNA拷贝数浓度；
[0017] (4)取待检测样品，提取待测样品基因组DNA，制得待检测扩增模板，按照步骤（3) 中定量PCR扩增的条件，检测样品的Ct值（循环阈值），对照标准曲线，得出待检测样品中 食树脂新鞘氨醇菌的DNA浓度。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中PCR扩增体系（共50 UL)如下：
[0019] 10XPCR 缓冲液 5yL，2. 5mM Mg2+4yL，4yL dNTPs(各 2. 5mM)，上述正向引物 1 y L(10mM)，上述反向引物 1 y L(10mM)，模板 DNA 2 y L，Taq DNA 聚合酶（5U)0. 5 y L，ddH20 32. 5 y L ；
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中PCR扩增程序如下：
[0021] 94°C预变性 5min ;94°C变性 lmin，62°C退火 30s，72°C延伸 40s，共 30 个循环；72°C 延伸lOmin。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的纯化为经质量百分比为1%的琼脂糖凝 胶电泳后，进行切胶纯化。切胶纯化可采用本领域的市售凝胶回收试剂盒进行操作，如 TIANGEN凝胶回收试剂盒。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的载体为PMD18T载体。该载体为普通市售产 品，如Takara公司有售。利用该载体进行连接的过程可以具体参见产品使用说明书。
[0024] 所述步骤（2)中的平板培养为采用含100 y g/mL氨苄抗生素的LB平板培养扩 大培养。LB培养基为本领域常用培养基，提取质粒可采用普通市售质粒提取试剂盒，如 TIANGEN的小量质粒提取试剂盒。
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤（3)和步骤（4)中定量PCR扩增体系（共25 y L)如 下：
[0026] 2XSuperReal PreMix(含SYBR GreenI) 10 y L，上述正向引物0? 5 y L(10mM)，上述 反向引物 〇? 5 y L(10mM)，DNA 模板 2 y L，ddH20 12 y L ;
[0027] 根据本发明优选的，所述步骤（3)和步骤（4)中PCR扩增程序如下：
[0028] 95°C预变性 15min ;94°C变性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 40s，共 40 个循环。
[0029] 根据本发明优选的，所述步骤（3)和步骤（4)中的定量PCR扩增采用Bio-red定 量PCR仪。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中的定量PCR扩增的扩增模板体积与步骤（4) 中的定量PCR扩增的待检测扩增模板体积相同；优选的，均为2 y L。
[0031] 有益效果
[0032] 1、本发明所述的引物根据食树脂新鞘氨醇菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异和 Real Time-PCR的引物要求设计的，可以应用于Real Time-PCR快速检测环境中的食树脂新 鞘氨醇菌，为研宄生物修复芳烃污染提供了新的途径；
[0033] 2、本发明所述方法不仅可以定性检测分析食树脂新鞘氨醇菌，而且可以定量检测 食树脂新鞘氨醇菌的浓度。
【附图说明】
[0034] 图1是实施例中NF/NR引物对14种细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图；
[0035] 图中：M泳道为标准D2000DNA Marker，1号泳道为食树脂新鞘氨醇菌 (Novosphingobium resinovorum， CGMCC1.3745)DNA 扩增产物，2-14 泳道分别为 地下新鞘氨醇菌（Novosphingobium subterraneum，CGMCC1. 3516)、胞外多聚物鞘 氨醇单胞菌（Sphingomonas sanxanigenens，CGMCC1. 6417)、苹果鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas mali，CGMCCl. 7044)、黑森新鞘氨醇菌（Novosphingobium hassiacum， CGMCC1. 3770)、刺状鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas echinoides，CGMCC1. 7036)、红色鞘 氨醇单胞菌（Sphingomonas rubra，CGMCC1.9113)、寡酷鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas oligophenolica，CGMCC1. 10181)、凯斯特鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas kaistensis， CGMCC1. 10197)、印度洋新鞘氨醇菌（Novosphingobium indicum，CGMCC1. 6784)、太湖新鞘 氨醇菌（Novosphingobium taihuense，CGMCC1. 3432)、冥河新鞘氨醇菌（Novosphingobium stygium，CGMCCl. 3767)、枯草芽抱杆菌（Bacillus atrophaeus Nakamura，ATCC9372)和多 粘类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa，ATCC 842)菌株DNA的扩增产物，15号泳道为不 含DNA空白对照的扩增结果。
[0036] 图2是本发明荧光定量PCR检测食树脂新鞘氨醇菌重组质粒DNA的扩增曲线；
[0037] 图3是本发明荧光定量PCR检测食树脂新鞘氨醇菌重组质粒DNA的溶解曲线；
[0038] 图4是本发明荧光定量PCR检测食树脂新鞘氨醇菌重组质粒DNA的溶标准曲线；
[0039] 图5是利用本发明荧光定量PCR检测添加与未添加食树脂新鞘氨醇菌的土壤荧光 定量PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0040] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0041] 培养基说明：
[0042] LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL， PH7. 0 ；
[0043] 生物材料来源：
[0044] 食树脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)来源于中国普通微生物菌种 保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 3745 ;
[0045] 地下新鞘氨醇菌（Novosphingobium subterraneum)来源于中国普通微生物菌种 保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 3516 ;
[0046] 胞外多聚物鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sanxanigenens)来源于中国普通微生 物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 6417 ;
[0047] 苹果鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas mali)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中 心，菌种保藏号CGMCC 1. 7044 ;
[0048] 黑森新鞘氨醇菌（Novosphingobium hassiacum)来源于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 3770 ;
[0049] 刺状鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas echinoides)来源于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 7036 ;
[0050] 红色鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas rubra)来源于中国普通微生物菌种保藏管理 中心，菌种保藏号CGMCC 1. 9113 ;
[0051] 寡酷鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas oligophenolica)来源于中国普通微生物菌种 保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 10181 ;
[0052] 凯斯特鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas kaistensis)来源于中国普通微生物菌种保 藏管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 10197 ;
[0053] 印度洋新鞘氨醇菌（Novosphingobium indicum)来源于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 6784 ;
[0054] 太湖新鞘氨醇菌（Novosphingobium taihuense)来源于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 3432 ;
[0055] 冥河新鞘氨醇菌（Novosphingobium stygium)来源于中国普通微生物菌种保藏管 理中心，菌种保藏号CGMCC 1. 3767 ;
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