用于直接检测结核分枝杆菌的方法
【专利说明】
[0001]发明的
技术领域
[0002]本发明描述了用于直接检测收集自外周血液、痰、支气管-肺泡灌洗液、浆膜炎泌出物的,以及总的来说,收集自从人体中累积的每一种生物学流体或组织样品的吞噬细胞内的结核分枝杆菌(以下称为M. TB.)感染的方法。所述检测涉及结合流式细胞术的免疫荧光。
现有技术
[0003]结核病是人类的现代鼠疫。世界上,在2007年记录了总数为1370万的流行TB病例,其中估计在2007年中的137万的群体感染结核TB病例合并感染有HIV。这对应全世界每100,000人206个病例的流行率,导致1756万例死亡(包括合并感染有HIV的456,000个TB患者)。在2007年,发生了 500,000个病例的多药耐药性TB(MDRTB),MDRTB被定义为感染有对最重要的一线药物中的至少两种(雷发平和异烟胼)有抗性的结核分枝杆菌菌株[I]。
[0004]截止2008年底,多药耐药性TB (XDR-TB)(被定义为另外地对氟喹诺酮和可注射药剂(例如卡那霉素、阿米卡星、紫霉素、或卷曲霉素)有抗性的MDRTB菌株)已经在世界上的55个国家和地区发现。(1,2)同时MDR-TB的治疗是困难和昂贵的,在多数发展中国家,XDR-TB几乎是不治之症。
[0005]世界卫生组织(WHO)已经估计总世界人口中的三分之一潜在地感染有结核分枝杆菌(以下称为LTB),而且在他们的生命期间,5% -10%的感染个体将发展活动性TB疾病。然而,发展活动性疾病的风险是每年5% - 15%,并且在HIV合并感染的个体中,一生的风险是50%。在低TB发病率国家中的多数活动性疾病的病例是发生自潜在感染个体的这一群体[1,2]。
[0006]预计LTBI个体的人数上升,尤其是在发达国家,这是由于增加数量的医学上免疫受损的患者,例如器官移植接受者和癌症患者,连同正用生物剂(抗-TNF-a剂、等)治疗的患者。此外,由于政治和经济问题,来自具有TB高发病率的国家的大量难民推测将移民。
[0007]被M. Tb.初侵染仅在10%的感染个体中导致疾病状态。其余的感染人群发展了诱导的免疫应答,由此避免了限于称为结节的细胞复合物的M. Tb.的进一步扩展。M.TB.在结节内不能繁殖,并且其结果是保持为潜伏的。虽然病原体可以潜在地恢复为它的恶性状态,尤其是在宿主处于减小的免疫监视时,即在HIV感染的情况下恢复为它的恶性状态,但是宿主因为以上原因仍保持健康。
[0008]用于诊断LTBI的目前已知的测试是排他地基于对MTBC抗原的宿主特异性细胞免疫进行评估的免疫学测试。在用结核分枝杆菌特异性抗原刺激后,检测T细胞应答的皮内测试(PPD-使用了超过100年)和最近引入的基于免疫力的干扰素-γ (IFN-γ)释放测定(IGRA)是针对LTBI 的主要测试[3] JGRA测定包括QuantiFERON-TB Gold,QuantiFERON-TBGold In-Tube (QFT-G-IT)、和T-SPOT. TB。在最近的荟萃分析中,IGRA的合并的敏感性是70% -90%,并且合并的特异性是93% -99%。对于QFT-G-IT看,在血液和血液外(extrasanguinous)流体中,针对诊断的活动性TB的合并的敏感性分别是80%和48%。针对T-SPOT的对应的敏感性是81 %和88%。在血液和血液外流体中,对于QFT-G-1T,合并的特异性分别是79%和82%,对于T-SP0T.TB,合并的特异性分别是59%和82% [4]。
[0009]然而,存在的问题是这些测试并不能将免疫记忆与真实感染区别开。来自科学界的目前指导建议,对pro抑或IGRA测定呈阳性的具有结核病风险因素的任何人都应服药。因此,不具有LTB但具有针对M.TB.具有抗原的获得特异性免疫的推定群体可以经受具有可能的严重副作用(即肝炎)的冗余治疗。例如,在HIV患者的整个生存期,他们发展结核病的风险(他们已经接受了专用的药物并且具有fymatin阳性测试)是50%,这意味着这一特定群体中的一半个体将接受针对LTB的冗余治疗。此外,结合抗逆转录病毒治疗的M.TB.治疗的副作用会使患者状态恶化,并且在一些情况下,会是危及生命的。
[0010]因此,从LTBI识别真实M.TB.感染的更特异性测试是高度令人希望并且是非常有用的,因为这些测试可以使得能够与那些已经通过获得性免疫破坏了芽孢杆菌、保持针对M.TB.抗原的免疫记忆的那些人相反,鉴定将真实地得益于LTBI治疗的个体。
[0011]因为目前的诊断测试(微生物学、核酸扩增测试)缺乏对特征化结核病(肺的抑或在肺外)和尤其严重版本的TB (例如结核性脑膜炎、多器官疾病、血行性播散)的足够的敏感性,所以高准确度的并且是迅速的M.TB.检测方法具有高度优先性并且一直在寻求之中。
[0012]目前用于TB诊断的方法缺乏敏感性,所以它们不能准确地排除TB。
[0013]常规微生物学测试(即直接涂片的和培养的测试)还缺乏用于诊断肺部TB的敏感性,其中估计30%的活动性肺部TB病例表现为痰涂片和培养阴性。此外,培养限制的结果是延迟的,在长时间(大约在十五天后)后才出现。
[0014]核酸扩增测试(NAAT)提供了增加诊断特异性的可靠方式(确诊疾病),但是敏感性太低而不能排除疾病,尤其是在涂片阴性TB的情况下。因此这些测试不能可靠地用于排除疾病,尤其是在其中临床诊断可疑的情况下,或在临床干预具有高度优先性时(5)。
[0015]其结果是,由于目前诊断学的缺点,在临床实践中,针对TBC的治疗学试验被用作治疗学诊断判据,尤其是在严重患病的患者中,尽管是阴性的诊断微生物学测试和分子测试。其结果是,这导致具有增加成本的不必需的治疗,并且在很多时候,这与治疗的严重副作用关联并且会是危及生命的。此外,Tb药疗法持续若干个月,通常是6-9个月。
[0016]本发明的方法的说明
[0017]本发明解决了上述问题,并且第一次提供了用于Μ.TB.检测(不仅在LTB病例中,而且还在伴随有严重形式的结核病的那些病例在)的直接的、敏感的并且特异性的方法。
[0018]Μ.TB.的主要感染路径涉及肺部。由于它们的小尺寸,吸入的微滴核躲过了支气管的防御,并且贯穿终泡,在那里它们由吞噬免疫细胞(巨噬细胞和树突细胞)吞食。结核分枝杆菌还可以感染肺泡腔(包括肺泡内皮)中的非吞噬细胞,以及I型和2型上皮细胞(肺泡细胞Μ6)。此外,大量微生物经由巨噬细胞被转移至引流淋巴结。
[0019]M TBC基因组的研宄已经使我们发现了存在于所有恶性的结核分枝杆菌和牛型结核杆菌菌株但是不存在于疫苗菌株牛型结核杆菌BCG中的称为差异I的区域(RDl)的基因组区(7-9)。结核分枝杆菌杆的毒力来自RDl产物并且尤其是来自ESAT-6和CFP-10蛋白。区域RDl是针对新疫苗的重要研宄领域,因为与BCG疫苗连同新治疗相比,它提供了更有效并且更有希望的位点。
[0020]近期研宄已经建立了在促进巨噬细胞感染和随后的细菌逃脱来感染其他附近细胞方面,结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统和ESAT-6蛋白的作用。De Jonge (德扬)等人
[10]已经不出,在宿主产生压力条件后结核杆菌被扰动时,由吞■体内活结核分枝杆菌分泌的ESAT-6: CFP-1O复合物分裂开。ESAT-6裂解产生小孔的吞噬体,杆菌进入细胞质,裂解细胞膜,并且然后感染其他宿主细胞(6)。该蛋白自身插入脂双层,导致结核分枝杆菌从吞噬体溶解和逃逸。更近地,证明了 ESAT-6导致I型和2型肺泡细胞的细胞裂解,并且证明了 ESAT-6诱导了协助杆菌传播至肺泡壁的裂解(6)。
[0021]本发明的诸位发明人的综合经验和他们关于结节感染的完整知识不仅涉及该研宄领域,而且还涉及临床的和实验室的实践,导致本发明的诸位发明人做出评估:由于ESAT-6的存在关系到代谢上活性的M.TB.,它的细胞内表达应是不仅针对活动性结核病,而且还针对LTB的有用生物标记。因此,我们认为,ESAT-6的这一细胞内表达应具有关于LTB的抑或结核病的预测价值,因为经由ESAT-6,它间接地鉴定了活的和恶性的杆菌,尤其是在敏感性太低的情况下。
[0022]截至现在,ESAT-6仍未按以下由本发明的诸位发明人描述的方式,由任何人被‘革巴向’为M.TB.的活性标记。此外,到目前为止,没有人已经想出实施此类方法用于诊断目的。直至现在,ESAT-6的用途局限于涉及M.TB.感染的病