多位点引入对硝基苯丙氨酸的人肿瘤坏死因子-α的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药和免疫学领域，涉及一种含非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸的 hTNF-a突变体蛋白的制备，该蛋白能够打破自身免疫耐受，增强hTNF-a的免疫原性，刺 激机体产生交叉抗体，成为治疗自身免疫疾病的候选疫苗分子。
【背景技术】
[0002] TNF- a是一种具有复杂生物学活性的细胞因子。但当TNF- a过量表达时，会与其 它炎症因子一起引起病理损伤，如自身免疫性疾病、恶液质和感染性疾病等。因此，中和体 内过量表达的TNF-a可治疗上述疾病。目前临床上使用的TNF-a拮抗剂有TNF-a单克 隆抗体和TNF-a可溶性受体，但这些药物存在用药量大、易引起超敏反应和需长期反复使 用等缺陷。疫苗只需少量注射就可以诱发产生抗体，可克服上述缺陷，因此TNF-a疫苗是 治疗此类疾病的潜在途径。TNF- a是自体蛋白，存在自身免疫耐受现象，难以诱发相应抗体 的形成。因此，如何突破免疫耐受，诱导免疫系统产生针对TNF-a的抗体，是疫苗设计与开 发中亟待解决的问题。
[0003] 目前，自体疫苗构建中用于突破免疫耐受的策略主要有三类。融合蛋白疫苗：此类 疫苗是通过将外源通用Th表位或能激活免疫系统的蛋白与抗原分子融合表达构成的。疫 苗分子构建的关键是：融合蛋白分子的合理构建和纯化，以使其可以保持合理的空间构象； 具有生产过程简便、成本低的优点。蛋白偶联疫苗：将改构的抗原或筛选出的抗原表位与 载体蛋白偶联，可构建蛋白偶联疫苗。此类疫苗无需免疫佐剂，且一个载体分子可以连接多 个抗原表位。目前常用的偶联的载体分子有匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH)、牛血清白蛋白（bovine serus albumin，BSA)、病毒样颗粒（Virus like particles， VLPs)和破伤风类毒素等。核酸疫苗：携带抗原基因的细胞因子DNA可被机体细胞摄取，随 后表达相应的抗原蛋白，这些蛋白被APC经MHC-I或MHC-II类分子途径提呈给⑶8+T细胞 或CD4+T细胞，诱导细胞免疫或体液免疫。
[0004] 大量研宄已经证实，通过化学修饰的方法引入具有免疫原性的化学基团，可以有 效的突破自体蛋白的免疫耐受，诱导机体产生免疫反应。由于缺电子的31系统趋于与对抗 体结合位点常见的Tyr和Trp侧链相互作用，硝基芳基可作为高免疫原性半抗原。
[0005] 应用遗传密码扩充技术可向蛋白质中定点引入非天然氨基酸。该项技术包括三 个关键组分：（1)正交性氨酰-tRNA/RS ; (2)正交性tRNA ; (3)含特殊密码子UAG的mRNA。 tRNA在正交性氨酰-tRNA合成酶的催化作用下加载非天然氨基酸，识别特殊密码子UAG，使 非天然氨基酸插入到该位点。该技术实现了蛋白质的定点修饰，以达到改变其生化性质及 药理作用的目的。
[0006] 61~11116￥31(1等人在旧831817282中制备的11^即-(1或}^即-(1突变体蛋白，成功产 生或增强了 TNF-a的免疫原性。这些突变蛋白均为单个位点引入对硝基苯丙氨酸的突变 体，本发明在此基础上，进一步改进了 hTNF-a突变体，实现两个位点同时引入对硝基苯丙 氨酸的hTNF-a的制备，通过免疫动物，该突变体蛋白能够刺激机体产生交叉抗体，与疾病 相关天然炎性因子TNF-a发生免疫反应，从而打破hTNF-a作为一种自体蛋白疫苗的免疫 耐受。与原型hTNF-a和单点突变体相比，其免疫原性均有所增强。该突变体蛋白可以作 为治疗自身免疫疾病的候选分子。
【发明内容】
[0007] 本发明选择TNF-a为靶分子，构建并表达了一种与之结构类似的hTNF-a突变 体，谓之非天然免疫原，其可在被动免疫中作为疫苗，刺激机体产生一种TNF-a交叉抗体， 从而与靶分子TNF- a结合，发生免疫反应，为自身免疫性疾病的治疗提供新的选择。
[0008] 本发明解决的第一个问题是通过密码子优化技术，设计并构建能够在大肠杆菌中 高效表达的不包含信号肽的hTNF-a及其突变体基因，突变体包括 ：a pN02Phen-hTNF-a， b pN02Phe87-hTNF-a，c pN02Phen'87-hTNF-a，将其连接至原核表达载体pBAD/Myc-His A， 得到hTNF-a及其突变体表达质粒。
[0009] 本发明解决的第二个问题是将突变体hTNF-a表达质粒和正交性pN02Phe_tRNA/ RS翻译系统共转化入表达宿主菌DH10B。
[0010] 本发明解决的第三个问题是，利用遗传密码扩充技术，实现定点引入非天然氨基 酸。将含有突变体hTNF-a的表达质粒和pN02Phe_tRNA/RS翻译系统的DH10B菌株在M9培 养基中扩大培养，添加或不添加非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸，经L-arabinose诱导表达 20h后，收集菌体，超声破菌上清液经Ni柱纯化，并通过SDS-PAGE和WB鉴定。
[0011] 本发明解决的第四个问题是，将非天然免疫原hTNF-a突变体注射给实验对象小 鼠，刺激产生针对非天然免疫原的抗体，且两点突变体产生抗体滴度高于单点突变体或原 型 hTNF-a 。
【附图说明】
[0012] 图 1 原型 hTNF-a 基因 〇verlap-PCR 结果
[0013] M ：250bp DNA Ladder ；
[0014] 1 :原型 hTNF-a 基因 〇verlap-PCR
[0015] 图2原型hTNF-a双酶切电泳结果
[0016] M ：250bp DNA Ladder ；
[0017] 1 :原型 hTNF-a 基因双酶切（Nco I 和 BamH I)
[0018] 图3 pBAD/Myc-His A双酶切电泳结果
[0019] 1 : pBAD/Myc-His A 质粒；
[0020] 2 : pBAD/Myc-His A 双酶切结果；
[0021] M： 250bp DNA Ladder
[0022]图4 pN02Phen-hTNF-a点突变结果
[0023] M： 250bp DNA Ladder ；
[0024] 1 : pN02Phen-hTNF-a 点突变质粒 PCR 扩增
[0025]图 5pN02Phe87-hTNF-a点突变结果
[0026] M： 250bp DNA Ladder ；
[0027] 1 : pN02Phe87-hTNF-a 点突变质粒 PCR 扩增
[0028]图6 pN02Phen'87-hTNF-a点突变结果
[0029] 1:pN02Phen'87-hTNF-a 点突变质粒 PCR 扩增；
[0030] M： 250bp DNA Ladder
[0031] 图7hTNF-a突变体表达Western Blot图
[0032] 1 : pN02Phen-hTNF- a不添加诱导剂；
[0033] 2 :pN02Phen-hTNF-a诱导表达样品；
[0034] 3 :pN02Phen'87-hTNF-a不添加诱导剂；
[0035] 4: pN02Phen'87-hTNF-a诱导表达样品；
[0036] M:蛋白分子量预染Marker