一种三维生物芯片基片制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有三维结构的生物芯片基片的制备方法。
【背景技术】
[0002] 生物芯片技术具有高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化等特点，自报 道以来一直受到生物、医学领域的广泛关注，在体外诊断、基因组学、药物开发等方向均具 有重要的应用前景。基材表面的化学处理是芯片制备的基础，合适的表面化学修饰策略也 是实现高灵敏度芯片制备的最直接的途径。目前生物芯片常用的载体主要分为无机（硅 片、玻片和金属等）及有机基材两类，通过对基材的适当处理，使用成熟的硅烷偶联剂表面 改性方法，可以方便地引入醛基、氨基、环氧、巯基等多种单层二维表面官能团以固定DNA/ 蛋白分子。但是，该类表面存在不能高密度固定生物分子的缺点，灵敏度和重复性方面仍然 面临巨大的挑战，也制约了生物芯片在临床常规诊断中的广泛应用。
[0003] 与二维表面相比，具有三维表面结构的基材可以在垂直表面的方向上固定更多的 生物分子，是实现生物分子在基材表面高密度固定化的基础。因此，有必要根据不同材质固 相载体的特点开发合适的表面化学修饰策略，制备出具有表面三维结构的生物芯片基片， 提高探针分子的固定密度，实现对被检测生物分子可重复的高灵敏度的定性和定量分析。
【发明内容】
[0004] 1.本发明的目的是提供一种三维生物芯片基片制备方法。
[0005] 2.本发明所提供的制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤：（1)首先在基片表 面引入羟基，然后硅烷化处理引入双键（2)在双键化基材表面通过紫外光接枝，得到具有 一定厚度表面含有环氧基团的基片（3)将上述基片置于含氨基的溶液中反应，制得表面含 有氨基的基片，为了方便下面表述，该方法记为I。
[0006] 3.上述方法I中所述的基片表面引入羟基的处理工艺：
[0007] 如果是玻璃基片，将玻片放入按氢氧化钾：水：异丙醇质量比为1:18:21配置的混 合液中，超声5~90min，再用去离子水清洗3次，然后用丙酮清洗、晾干；
[0008] 如果是聚合物基片，将聚合物基片在丙酮中清洗并晾干，将30wt%的过硫酸铵水 溶液夹在双向拉伸的BOPP和聚合物膜中间，形成100nm~10ym的液层。然后用紫外灯在 室温下从B0PP表面照射0. 5~3min，将得到的改性聚合物膜用去离子水冲洗，并浸入超纯 水中1~16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
[0009] 4.上述过程中所述聚合物基片为聚碳酸酯（PC)、聚苯乙烯（PS)、聚甲基丙烯酸甲 酯（PMMA)、聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物、环氧树脂（EP)、环烯烃共聚物（C0C)或聚二甲基硅 氧烷（PDMS)片基。
[0010] 5.上述方法I中所述的表面双键化的工艺：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋 酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为1-10 %，冰醋酸的质量浓度为 0.05% -0.2%，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡10-30min，然后用乙醇清洗，吹 干。
[0011] 6.上述方法I中所述的通过光接枝法引入三维凝胶层的工艺：
[0012] ①配置接枝混合溶液，包括光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)和甲基丙烯 酸缩水甘油酯（GMA)组成的单体，余量为溶剂；
[0013] ②将接枝混合液滴在基片上，并用石英片覆盖在表面使接枝液均匀分布在基片 上，置于紫外光下照射1~60min，之后将接枝基片用乙醇浸泡1~10h，晾干；
[0014] 7.所述的接枝混合溶液中PEGDA:GMA的摩尔比为1:0.1~0.1 :1，单体所占混合 溶液的质量分数为5~80% ;
[0015] 所述的接枝混合溶液中的溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚 砜、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；
[0016] 所述的接枝混合溶液中的光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮、安息香双甲醚、 2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮中的一种或两种以上的混合物，质量浓度为0. 05~5% ;
[0017] 所述紫外光的波长为100~350nm，紫外光的强度为2000~12000yW/cm2。
[0018]8.上述方法I中所述的制备表面接有氨基的三维凝胶结构基片的工艺：配置质 量浓度为〇. 01 %~5%的含氨基化合物水溶液，将含有环氧基团的基片置于此溶液中浸泡 0. 5h~24h，用去离子水清洗3次后在室温下晾干。
[0019] 9.上述方法I中所述的含氨基的化合物可以是乙醇胺、乙二胺、丙二胺、羟乙基乙 二胺、异丙醇胺、丁醇胺、丝氨醇及三羟甲基氨基甲烷、壳聚糖（CTS)、聚乙烯亚胺（PEI)、聚 赖氨酸（PLL)中的一种或两种以上的混合物。
[0020] 10.由上述任一所述方法制备得到的生物芯片基片也属于本发明的保护范围。
[0021] 11.由上述任一所述基片制得的生物芯片也属于本发明的保护范围。
[0022] 12.本发明的基片是一种三维凝胶结构表面具有氨基修饰的基片，固相载体可以 是无机材料，也可以是聚合物膜。具体的说是先将固相载体经过表面改性处理，然后表面羟 基化-表面烷基化-表面接枝三维凝胶层-最后通过环氧基活性基团接枝上富含氨基的分 子，在基片上接枝形成的一定厚度的凝胶层，在生物芯片的点样过程中，可以在深度上固定 更多量的探针，这样可以制备出固定密度高，检测灵敏度高的生物芯片基片。本发明基片针 对不同的固相载体分别做了介绍，为不同应用领域生物芯片的制备提供了前提和依据，所 述基片制备方法操作简单，探针固定固定效率高且重复性好。
【附图说明】
[0023] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制，在附图中：
[0024]图1是根据本发明实施例1制备的三维结构氨基化的玻璃基片，根据本发明实施 例11进行的生物芯片点样固定后的扫描结果图。
[0025] 图2是根据本发明实施例1制备的三维结构氨基化的玻璃基片，根据本发明实施 例11进行的生物芯片点样固定后，经过包含5XSSC，0. 1%SDS和1. 0%BSA的清洗液清洗 后的扫描结果图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 三维结构氨基化玻璃基片制备
[0029] (1)片基的羟基化：将玻片放在配置好的KOH，水，异丙醇（质量比1:18 :21)的混 合溶液中，超声15min，用去离子水清洗2次，再用丙酮清洗备用。
[0030] (2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基 三甲氧基硅烷的质量浓度为1%，冰醋酸的质量浓度为0. 1%，将表面活化的基片放入上述 溶液中，浸泡30min，然后用乙醇清洗，吹干。
[0031] (3)片基的三维结构制备：配置光引发剂（1-羟基环己基苯基甲酮）、PEGDA和GMA 的混合液，丙酮为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为5%，PEGDA:GMA的摩尔比为10:1，单体 所占混合溶液的质量分数为20%，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的玻片上，在紫外 灯下室温照射lOmin，用乙醇室温浸泡10h，晾干。
[0032] (4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的玻片置于PEI溶液中（质量 浓度为〇. 5% )，室温浸泡30min，清洗。
[0033] 实施例2
[0034] 三维结构氨基化环烯烃共聚物（C0C)基片制备
[0035] (1)片基的羟基化：将C0C膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt%的过硫酸铵水溶液 夹在双向拉伸的B0PP和C0C膜中间，形成大约0. 5ym的