一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]肺癌是当前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居世界肿瘤相关疾病死因的首位。在大多数的病例当中，患者就诊时已经是不可切除的病变或者无法治愈的疾病状态。局部进展期或者一般情况较好的非小细胞肺癌患者可以接受同步放化疗，联合或不联合手术治疗，这样可以获得平均8个月的无疾病进展生存，但是5年总生存率仍小于15%。
[0003]因此迫切需要新的更有效的肺癌治疗模式。近年来，在人们不断探索的肿瘤治疗新方法中，免疫治疗是一种治疗肺癌的有效新方法。肺癌免疫治疗是一种极具前景的治疗方法。目前已经发现了一些肿瘤免疫学治疗的靶点:
MUCl是一种跨膜糖蛋白，它在正常的管道上皮中都有表达，如乳腺、前列腺、肺、胃、膀胱和汗腺等。它的正常功能是与黏蛋白的形成有关，然而，在肿瘤当中它的作用发生了改变，过量的糖蛋白表达会导致免疫活性的产生。高度的MUCl表达可以增加癌症的侵袭性，导致肺癌患者的不良预后。不仅如此，MUCl的过度表达也会激活PI3K和AKT通路，导致肿瘤的增殖。
[0004]MAGE-A3，人类黑色素瘤抗原(MAGE) -A, -B，-C是一个基因家族，它是胚胎来源的正常表达抗原，也在人类特殊免疫组织部位表达。诸如黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌、食管癌以及肺癌的肿瘤细胞可表达此类抗原，因而它被认为是肿瘤相关性抗原。MAGE-A3是这个家族基因的一个亚型，在早期(35%)及进展期(55%)肺癌中的表达存在差异，于是被认为是免疫治疗的一个非常好的靶点。
[0005]抗原PRAME，它参与维A酸受体抑制，在黑色素瘤及非小细胞肺癌中高表达，因此可以作为一个疫苗靶点。
[0006]尽管已经发现了上述潜在的肿瘤免疫治疗靶点，然而肿瘤免疫治疗尚面临诸多问题。例如上述肿瘤抗原由于来自机体自身，因此免疫原性通常都很低。如何提高肿瘤抗原的免疫原性是当今肿瘤治疗领域的重大科学难题。
[0007]2014年德国默克公司宣布公司开发的新型抗癌疫苗药物Tecemotide (mucl抗原特异性的抗癌疫苗)临床三期研宄宣告失败。就在不久之前，葛兰素史克公司开发的抗癌疫苗MAGE A-3也在临床三期研宄中宣告失败。这些试验的失败原因很大程度上是因为肿瘤抗原免疫原性低，疫苗无法诱导出足够强度的免疫应答。
[0008]诱发机体产生免疫应答的关键步骤在于抗原如何有效被抗原提呈细胞(APC细胞)提呈到免疫细胞表面。机体内的APC细胞主要为树突状DC细胞。
[0009]自噬作用最初被认为是细胞在营养缺乏或受到外界应急情况下，降解自身细胞内一些成分获得营养从而能够存活下来的机制。近来的研宄表明自噬在固有免疫、适应性免疫中也发挥了重要的作用。有研宄数据表明机体能通过自噬机制提呈内源性蛋白抗原，并激发相应的免疫应答。
[0010]只有增强肿瘤抗原的免疫原性，使之能在体内引起更有效的肿瘤特异性免疫应答，并且观察到临床疗效，肿瘤的免疫治疗才能真正使得人类获益。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒及其在制备用于预防或治疗癌症的制剂中的应用。
[0012]本发明所采取的技术方案是:
一种重组腺病毒，其携带自噬相关蛋白与肿瘤相关抗原的融合蛋白的编码序列。
[0013]作为优选的，所述自噬相关蛋白为LC3b蛋白。
[0014]作为优选的，所述肿瘤相关抗原为黑色素瘤特异性抗原(PRAME)或人类黑色素瘤抗原(MAGE-A3)或 MUC1。
[0015]所述融合蛋白的编码序列从5’到3’依次具有:肿瘤相关抗原编码序列、任选的连接狀编码序列和自■相关蛋白编码序列。
[0016]所述融合蛋白编码序列的插入位点位于腺病毒的El基因或E3基因区域。
[0017]所述腺病毒为2型腺病毒或5型腺病毒或55型腺病毒。
[0018]以上所述的重组腺病毒在制备用于预防或治疗癌症的制剂中的应用，所述癌症是指肺癌。
[0019]一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包括以上所述的重组腺病毒。
[0020]所述药物组合物中还包括药学或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
[0021]本发明的有益效果是:
通过将肿瘤特异抗原与自噬基因融合，并利用腺病毒载体高效率感染机体APC细胞，二者协同作用可增强机体对肿瘤靶标抗原的免疫应答水平，具有明显的抗肿瘤效果。
【附图说明】
[0022]图1:表达肺癌特异抗原的重组载体的构建和鉴定；
图2:通过ELIS0P0T技术检测针对肿瘤特异抗原的细胞免疫应答水平；
图3:通过流式细胞技术检测针对肿瘤特异抗原的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫应答水平；
图4:携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒在小鼠肿瘤模型中起到了良好的杀伤肿瘤细胞的作用。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0024]以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025]实施例1携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒的构建和鉴定
下面以腺病毒中插入肺癌相关抗原(PRAME、Muc-1、MAGE-A3)与LC3b蛋白的融合蛋白编码序列制备重组腺病毒为例，对本发明的增强肿瘤抗原免疫原性策略作进一步的说明。
[0026]从NCBI数据库中得到LC3b基因序列，如SEQ ID N0.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，通过全基因合成得到LC3b基因。携带有人PRAME全长ORF cDNA序列的PVAX载体由本实验室保存。PRAME全长ORF cDNA如SEQ ID N0.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0027]按常规分子克隆技术方法将靶标基因PRAME全长ORF cDNA与LC3b基因融合，其融合基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0028]Muc-1基因序列如SEQ ID N0.6所示，其与LC3b基因的融合基因序列如SEQ IDN0.7所示。
[0029]MAGE-A3基因序列如SEQ ID N0.8所示，其与LC3b基因的融合基因序列如SEQ IDN0.9所示。
[0030]按照本实验室常规的重组腺病毒构建方法，将LC3b，PRAME，PRAME_LC3b，MAGE-A3，MAGE-A3-LC3b，Muc-1, Muc-l_LC3b分别构建到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了 El和E3区域的人2型或5型或55腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID50和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用(相关方法的具体操作步骤可参见本团队先前的专利，授权专利号:ZL 2007 I 0026295.X)。图1 中 A 是肿瘤抗原基因(如 PRAME, MAGE-A3，Muc-1)与LC3b融合的示意图；图1中B是携带目的基因的重组腺病毒的构建鉴定图；图1中C是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图，可见纯化的重组腺病毒可以高水平的表达目的蛋白。例如Ad5-PRAME可表达55KD左右的靶标蛋白，并且不能被LC3b抗体认别(条带1)，只能被PRAME抗体认识(条带3) ;Ad5-PRAME-LC3b表达的条带大小约为72Ka和55Ka，且该目标蛋白既能被LC3b抗体认别(条带2)，也能被PRAME抗体认识(条带4)，这表明融合蛋白表达正确。
[0031]同样，实验结果表明:Ad5-Muc-l-LC3b和Ad5-MAGE-A3_LC3b融合蛋白表达正确。
[0032]实施例2、携带肿瘤融合抗原的重组腺病毒在小鼠模型中可显著增强肿瘤抗原的免疫原性
进一步研宄融合了 LC3b的上述基因是否能够在机体内发挥作用而有效的提高T淋巴细胞反应。
[0033]1.实验材料
1.1流式抗体
所用单克隆抗体，抗鼠 ant1-CD3-PerCP, ant1-CD4_FITC and ant1-CD8_APC (BDB1sciences) ant1-1FN-γ-PE, ant1-TNF-a-PE-cy7, ant1-1L-2-APC_cy7 (BDPharmingen)购自 BD 公司。
[0034]1.2肿瘤抗原多肽
肿瘤多肽由本实验室合成，大部分肽由15个氨基酸组成，两两之间有11个氨基酸重叠.纯度>80%。用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成0.4mg/ml/肽的储存液，分装后_70°C保存。
[0035]1.3其他试剂
ELISP0T板(品牌！Millipore ;货号:MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIVgag蛋白购自苏州杰恩生物技术有限公司，TMB/E底物(货号:ES001)购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物(品牌:PierCe ;货号:34042)购自广州吉泰生物科技有限公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶(品牌:BD PharMingen，货号:554065)购自基因有限公司。
[0036]2、实验方法
2.1实验动物和免疫策略
每组10只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫剂量为50ug/100ul/只；腺病毒疫苗免疫剂量为I X 19Vp/只/ΙΟΟμ?，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50μ?。共免疫4次，间隔2周。免疫2次DNA疫苗后(即4周)，每组随机取4只，处死，进行免疫检测。剩余4只继续注射重组腺病毒疫苗。
[0037]2.2多色流式技术检测多功能T细胞
I)分离好的PBMC细胞计数后调整至2X 106/ml，加入到96孔培养板，每孔200ul。培养基为R10。
[0038]2)在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMS0，阳性对照加入佛波酯(PMA) (20ng/ml) +离子霉素(1000ng/ml)。