一种将hpalXoo基因转入短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法
【专利说明】—种将基因转入短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是指一种将如基因转入短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法。
【背景技术】
[0002]定向的改造野生型菌株，使之适合不同环境、不同靶标的生物防治，无疑具有重要的理论和现实意义。因此近年来，人们开始热衷于利用分子生物学及分子遗传学的手段进行生防菌的遗传改良，改善它们对环境条件的适应性、扩大应用范围。芽孢杆菌表达系统中研究较成熟的菌株是枯草芽孢杆菌，但是由于其胞外蛋白酶活性很强，会大量降解外源蛋白，所以在构建工程生防菌株时造成较大的局限性；苏云金芽孢杆菌虽然胞外蛋白酶活性不高，但是野生菌株中含有大量的内生质粒，而这些内生质粒对外源基因的导入和表达带来较大的影响；短芽孢杆菌和短短芽孢杆菌则只有枯草芽孢杆菌的1.6%胞外蛋白酶活性(Udaka etal.1993)并且细胞壁较薄，内生质粒较少,所以成了生防菌株和外源蛋白表达系统构建中宿主细胞的重要选择。
[0003]目前外源基因导入宿主菌的主要手段有感受态法、原生质体转化法和电击转化法。原生质体转化法虽然有较高的转化率，但由于短芽孢杆菌细胞壁的特殊结构(由外蛋白层和内肽聚糖层组成)，去掉细胞壁后的原生质体再生非常困难，原生质体转化法不能运用于短芽孢杆菌(UDAKA S.etal 1989)。其中，电击转化法被认为是转化效率最高的一种方法。然而，电击转化过程中需要平衡转化效率和死亡率的关系，随着电场强度的增加，外源DNA进入宿主细胞的可能性越大，死亡率也随之增加。陆雁等以不同预培养时间优化复制子转化至枯草芽孢杆菌WB600中，最高转化率为2.58 X 14 cfu/ug ;王培培等对枯草芽孢杆菌NCD电转化条件进行优化，最高效率为6.07 X 14 cfu/ug ;而目前芽孢杆菌电击转化的转化效率最高为1.4X106 cfu/ug，还不能满足高效率转化，如构建基因文库的要求。且电击转化法对试验技能有较高的要求，电场强度是电击转化中最敏感的参数，直接影响转化效率；外加电场引起细胞部分原生质化，在没有特殊再生条件的情况下，部分转化子将会死亡，降低了转化子获得率。李瑞芳等(2011)比较了电击转化法和本研究所使用的化学转化法对枯草芽孢杆菌分泌表达的影响，发现电击转化法对细胞分泌表达的损伤大于化学转化法。
[0004](彭清忠等2004)也尝试用适用于各种细菌转化的TSS法转化5株短芽孢杆菌，但都未成功。由此看来，此方法并不是对每种细菌都适用。短芽孢杆菌由于其特殊的细胞壁结构以及各菌株之间的结构差异，找到一种通用的有效转化方法还存在一定困难。Tris-PEG方法是一种新的转化短芽孢杆菌的方法。Udaka等利用此方法转化具有双层细胞壁蛋白的短芽孢杆菌47时非常成功，最佳条件下转化率高达105~ 16个转化子/ UgDNA。但在转化仅有I层细胞壁蛋白层的短芽孢杆菌HPD31时获得非常低的转化率或没有转化子获得。彭清忠等也利用此方法尝试对5株野生短芽孢杆菌进行转，仅50号和735号菌获得成功，且转化效率非常低(最高转化率102个转化子/ ugDNA)。总体看来，Tris-PEG转化方法并不适合于所有的短芽孢杆菌，而且由于菌株的不同，转化效率有很大的区别。周海燕等(2008)采用Tris-PEG将重组质粒转化至短短芽孢杆菌且其酶活力显著提高。所以这些例子都为功能基因的研究奠定了基础。
[0005]HAB-5是一株从棉花根际土壤分离出来的拮抗细菌，经16SrRNA初步鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevs)，研究发现其对多株植物病原真菌具有强烈的抑制作用，且在促进植株生长，防治植物病害方面也有一定的作用。
[0006]hpalXoo是来自水稻白叶枯病菌(Z oryzae pv.0ryzae)菌株JXO III的ArjD基因簇中的hpa (harpin-associated)基因,编码harpinXoo蛋白。这种蛋白具有Harpin的特征，且可诱导植物产生多种有益表型。
【发明内容】
[0007]本发明提出一种将基因如Wzra转入短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法，操作简便，重复性好，转化率高。
[0008]本发明的技术方案是这样实现的:
一种短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法，包括以下步骤:
(1)将短短芽孢杆菌HAB-5在LB平板上活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养得短短芽孢杆菌HAB-5菌液；
(2)转接经步骤(I)培养的HAB-5菌液到MD培养基中培养；
(3)离心后倒去上清液剩余悬浮菌体，即得HAB-5悬浮菌体溶液；
(4)HAB-5悬浮菌体溶液加入如!混合菌液，200-250rpm振荡培养；
(5)加入混合菌液体积10倍的LB，200-250rpm振荡恢复培养；
(6)离心后除去上清液，即得含有hpalXoo基因的HAB-5；
进一步，所述步骤(I)培养条件为，27-29°C振荡160-180rpm培养12-16个小时。
[0009]进一步，所述步骤(2)培养条件为，27-29°C振荡160_180rpm培养3-5 h ；
进一步，所述步骤(2)中MD培养基每10 mL中含有以下组分:10XPC缓冲液0.92mL,
50%葡萄糖 0.1mL (115°C灭菌 30min), 5mg/mL_ 色氨酸 0.1mL, 2.2mg/mL 朽1 檬酸铁铵 0.005mL, 0.5mol/L 天门冬氨酸钾 0.24 mL, lmol/L 硫酸续 0.03 mL。
[0010]进一步，所述的10XPC缓冲液各组分的摩尔浓度为:磷酸二氢钾44mmol/L，磷酸氢二钾60mmol/L,朽1樣酸三钠30mmol/L。
[0011]进一步,所述步骤(3)中离心条件为,8000-10000 rpm,离心8_12min ;
进一步，所述步骤(4)中hpalXoo的加入量为每毫升悬浮菌体溶液加入0.5-0.8 Ug的如振荡培养条件为温度27-29°C、培养2_3h ；
进一步，所述步骤(5)中恢复培养过程中，控制温度27-29°C，培养培养时间为2-3 h。
[0012]进一步,所述步骤(6)离心条件为8000-10000rpm离心10_12min。
[0013]本发明的有益效果:
本发明转化短短芽孢杆菌的转化方法属于化学转化法，经过多次转化，最高转化率可高达14个转化子/ug DNA0且将得到的转化子超声破碎得到的粗蛋白注射到烟草叶片中，25°C ±1°C下放置，24h后观察烟草叶片有过敏性反应发生。说明转入的如Wzra基因在短短芽孢杆菌中能高效稳定表达。本发明建立的将如基因转入短短芽孢杆菌HAB-5的化学转化方法，操作简便，营养要求低，仪器设备无特殊要求，耗时短，重复性好，转化效率高，对于构建更高效的生防菌株具有积极的促进意义。
【附图说明】
[0014]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]图1为HAB培养后的菌落生长情况；
图2为实施例1所得转化子菌落生长情况；
图3为实施例2转化子菌落生长情况；
图4为实施例3转化子菌落生长情况；
图 5 为突变体的PCR检测，图中，M:2000Mark ；1: Blxoo ；2:B2xoo ；3:B3xoo ；4:B4xoo ；5:B5xoo ;6:作为重组融合蛋白GST-harpinXoo的宿主菌株E.coli菌株BL21 (DE3)；7:HAB-5 ；
图 6 为 PCR Southern Blot 验证，图中，MiMarker ；1:HAB-5 ；2:B4xoo ；3:B5xoo ；
图7为烟草的过敏性反应检测，图中，a:ddH20 ；b: GST-HarpinXoo粗蛋白；c:HAB-5粗蛋白；d:B5xoo粗蛋白
图8为菌体总粗蛋白SDS-PAGE电泳，图中，M =Protein Marker ；1:HAB-5粗蛋白2:GST-HarpinXoo 粗蛋白 3:B5xoo 粗蛋白。
【具体实施方式】
[0016]下面将结合