一种用于鉴定莱菔子的引物对及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用 于鉴定莱菔子的引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 据2010年版《中国药典》一部记载，莱菔子来源为十字花科植物萝卜Raphanus sativus L.的干燥成熟种子。莱菔子是临床较常用中药，具有消食除胀、降气化痰的功效， 用于饮食停滞，脘腹胀痛，大便秘结，积滞泻痢，痰壅喘咳。近些年，莱菔子在商品中经常与 同科植物欧白芥、油菜以及旋花科植物菟丝子或南方菟丝子等植物的种子混淆使用，为确 保药材市场中莱菔子的质量及其临床疗效，需建立更加快速、准确的方法来鉴定莱菔子与 其混伪品。
[0003] 不同研宄学者分别采用薄层色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、显微方法等 对莱菔子进行鉴定（张素芹，刘娟，冉玫等.莱菔子及其伪品的蛋白电泳鉴别，中国 中药杂志，2006,31(17):1467;朱缨.白芥子与莱菔子的比较鉴定方法.实用医技杂 志，2006, 13 (5) : 743.)，但这些方法比较繁琐，不利于推广。
[0004] DNA分子标记技术是近二十年来兴起并不断发展和完善的新检测技术。而就DNA 分子标记技术在药用植物鉴定中的应用而言，DNA分子标记则是从分子水平上客观地反映 待测材料基因片段之间的差异，鉴别结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，一般 通过杂交或电泳等方式就能直观地体现出来，结果更为准确可靠。
[0005] 综上所述，不同研宄学者分别采用显微、理化及蛋白电泳方法对莱菔子药材进行 鉴定研宄，但显微、理化这些传统方法主观性强，不利于标准化、规范化。蛋白电泳技术测试 时间较长，且需要电泳检测才可完成，因此相比较荧光染色方法繁琐，不利于现场快速鉴别 的应用与推广。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定莱菔子的引物对。
[0007] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定莱菔子的引物对，具体为由序列表中序列1 和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0008] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定莱菔子的试剂盒。
[0010] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定莱菔子的试剂盒，具体可含有所述引物对、 dNTP和DNA聚合酶。
[0011] 根据需要，所述试剂盒中还可含有荧光染料SYBR Green I。
[0012] 制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0013] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别 单独包装的步骤。
[0014] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0015] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：
[0016] A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
[0017] B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包装于同一个试剂盒内。
[0018] 所述引物对，或所述试剂盒，在鉴定或辅助鉴定莱菔子中的应用也属于本发明的 保护范围。
[0019] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品中是否含有莱菔子的方法。
[0020] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品中是否 含有莱菔子的方法，具体可包括如下步骤：
[0021] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增；
[0022] (b)为如下（bl)或（b2):
[0023] (bl)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有 莱菔子：若PCR产物中含有250-500bp (如350-370bp)的DNA片段，则所述待测样品中含有 或候选含有莱菔子；若PCR产物中不含有250-500bp (如350-370bp)的DNA片段，则所述待 测样品中不含有或候选不含有莱菔子；
[0024] (b2)向步骤（a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，按照如下方法 确定待测样品中是否含有莱菔子：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测样品 中含有或候选含有莱菔子；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测样品不含 有或候选不含有莱菔子。
[0025] 在所述方法的步骤（b2)中，向所述反应体系中加入荧光染料SYBR Green I时， 所述荧光染料SYBR Green I的加入量为：每20 y L所述反应体系中加入1 y L 100 X SYBR Green I (Invitrogen公司，其产品目录号为1135054)。
[0026] 在所述方法的步骤（b2)中，确定所述反应体系是否产生绿色荧光具体是在365nm 紫外波长下进行检测的。
[0027] 在所述方法中，所述莱菔子为中药材。当然所述方法也可以用于检测莱菔子的基 原植物--萝卜（Raphanus sativus L.)。相应的，所述待测样品既可为单一或混合的中药 材成品，也可以为植株。
[0028] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测样品为莱菔子，还是菟丝子、紫苏子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子 中的任一种的方法。
[0029] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测样品为莱菔 子，还是菟丝子、紫苏子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一种的方 法，具体可包括如下步骤：
[0030] (a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增；
[0031] (b)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品为莱菔 子，还是菟丝子、紫苏子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一种：若 PCR产物中含有250-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为莱菔子；若PCR产物中 不含有250-500bp的DNA片段，则所述待测样品为或候选为菟丝子、紫苏子、白芥子、青葙 子、沙苑子、急性子、冬葵子和油菜子中的任一种；
[0032] 所述待测样品为莱菔子、菟丝子、紫苏子、白芥子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子 和油菜子中的任一种（即可为中药材也可为基原植物）。
[0033] 在上述两方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为70°C。
[0034] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：94°C lmin; 90°C 15s、70°C 20s、28 个循环。
[0035] 在上述两方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每 条单链DNA分子的终浓度均为125nM。
[0036] 在本