一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸杂交检测领域，涉及一种检测人肺细胞中let-7a的方法，具体 地，本发明涉及一种基于DNA四面体基底和粘性末端介导的链置换反应构建的单分子计数 策略检测miRNA的方法。
【背景技术】
[0002] microRNA (简写miRNAs)是一类小的、内源性非编码RNA分子（18-24个碱基），通 过介导mRNA切割或翻译抑制参与基因表达的调控。u这种调节性功能使得miRNAs能够调 节细胞增殖、分化和凋亡。 3'4最近，大量证据表明，miRNA的异常表达与癌症的发生、肿瘤的 形成和肿瘤对治疗的应答直接相关。 3,5因此，miRNAs已被当做癌症诊断和预防的生物标志 物。4' 6'7N〇rthern印记法、定量实时PCR技术和微阵列技术是miRNA检测的常用方法，但是 这些方法具有灵敏度低、样本制备过程复杂和特异性差的缺点。为此，许多新的方法已 经被建立起来，以期提高miRNAs分析的准确性。 1h7其中，由于具有灵敏度高和易于操作 的优点，荧光法是最常见的一种。 14_17然而，由于miRNAs链短、浓度低和序列相似性高，对 miRNAs的准确识别仍然是一个挑战。 18现有的miRNA识别探针都是线型或构象限制型的， 它们与目标物的杂交属于直接杂交方式，即，仅涉及两条单链核酸的杂交。 12'13'16'17'19虽然 碱基互补配对是自然界中特异性最高的识别方式之一，这种直接杂交的方式仍然很难实现 碱基错配的识别。 19'2°因此，对miRNAs的选择性检测来说，更加严格的识别是十分必要的。
[0003] 粘性末端介导的链置换反应（SDR)是由目标物和一段短的单链部分（成为"粘性 末端"）杂交触发的一种可调控的无酶杂交反应。21与直接杂交方式不同，粘性末端介导的 SDR是通过链迀移过程实现的。也就是说，在探针-目标物反应体系中，有一个额外的竞争 者，其结合区域的碱基序列与目标物相同。 2°_23当无目标物存在时，竞争链可以与探针形成 稳定的双链结构，当有目标物存在时，该链即可被替换。这种杂交策略能够区分探针和目标 物杂交时自由能的微小变化，能够通过动力学的方式识别单碱基错配。 24因此，与目标物有 单碱基之差的序列不能触发链迀移过程。与简单的沃森-克里克碱基配对相比，粘性末端 介导的SDR能够增强核酸识别的特异性，通过调节粘性末端的长度和序列组成即可实现有 效的序列识别。 2^24
[0004] 单分子计数是一种新型定量方法，与传统的强度测定法不同，这种方法通过清点 目标物的个数进行定量，因此更加适用于超低浓度生物标志物的检测。 25, 26, 27现存的单分子 计数方法大都需要将目标物固定在基底上，固定能够起到富集和分离的作用，也能保证目 标物分子静止在视野中，以便长时间观察。 28,29,3°但是，依赖于固定的单分子计数方法具有 两个问题，一个是基底的非特异性吸附问题，能够导致假阳性信号的产生，降低方法的灵敏 度。解决这个问题的常用方法是对基底进行封闭，但是封闭剂的使用可能会阻碍目标物与 结合位点的靠近，使目标物难以结合到基底上。 31，32, 33另一个是由于基底上探针分布不均而 造成的目标物和探针结合效率低的问题。34为了解决这两个问题，我们课题组构建了一个 DNA四面体基底，并对不同基底的QDs吸附问题进行了探宄，结果表明，DNA四面体能够有效 地抑制QDs的非特异性吸附。35此外，DNA四面体结构还能够有效控制探针的方向和密度， n，34, 35因此，能够实现较低的非特异性吸附和较高的检测效率〇 35
[0005] 文献《利用DNA四面体纳米结构单分子定量检测生物分子》建立了与本文相类似 的miRNA检测方法，但仅仅对该方法的实验条件进行了优化，并没有实现目标物的定量检 测，没有实际应用的价值。而本工作侧重于对miRNA的定量分析及特异性分析，不仅实现了 缓冲溶液中标准miRNA的定量，还实现了复杂生物样本中miRNA的定量。
【发明内容】
[0006] 为克服现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于DNA四面体基底和粘性 末端介导的链置换反应构建的单分子计数方法，用于microRNA的高选择性检测，以期提高 microRNA定量检测的准确性。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 一种人肺细胞中let-7a的检测方法，具体实施步骤如下：
[0009] (1)组装DNA四面体探针，得到DNA四面体溶液；
[0010] (2)制备硅烷化的玻璃基底，然后将DNA四面体溶液加入基底，孵育，然后用PBS缓 冲液将多余的DNA四面体洗掉，得到DNA四面体基底；
[0011] (3) let-7a的单分子检测：首先将待测物分别加到含0. 1，0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5和 0. 6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将待测样本分别加入制备好 的DNA四面体基底中，37°C进行第一次孵育；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入生 物素化的ssDNA探针（bio-RP)，37°C下进行第二次孵育；PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗 三次，加入链霉亲和素化的量子点（QDs)，37°C下进行第三次孵育；采用PBS-T和PBS缓冲 液先后分别清洗三次后，加入PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点 的个数，作出标准曲线方程，通过计算得到let_7a的浓度。
[0012] 步骤⑴中，DNA四面体探针的组装属于本领域常规技术，一般由四条单链DNA 通过自组装而得。本方法中四面体的特点在于，在四面体的一端设计了一个带有粘性末端 的发夹结构，其作用是实现miRNA(let-7a)的特异性识别。本发明中的DNA四面体探针由 A-HP，B-NH2, C-NH2和D-NH24条DNA链通过自组装形成，其序列如下：
[0013] A-HP：
[0014] ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTTAACTATACAA CCTACTACCTCAITITITITTGAGGTAGTAGGTTGT (下划线部分为粘性末端）。
[0015] B-NH2：
[0016] NH2-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTC CA ATAC 〇
[0017] C-NH2：
[0018] NH2-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGC TCTTC。
[0019] D-NH2：
[0020] NH2-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCT CGCAT。
[0021] 步骤（1)的具体实施方法如下：将四条DNA链（A-HP，B-NH2, C-NH2和D-NH2)稀 释到50 y M，各取2 y L到92 y L TM缓冲液中，混匀后，95 °C退火2min，冰浴，最终得到的DNA 四面体的浓度为1 UM。
[0022] 其中，所述TM缓冲液由Tr i s、MgCljP水组成，其中，各组分的浓度为：20mmo 1 I^TrisJOmmol L-1MgCl2，PH 8.0〇
[0023]步骤（2)中，硅烷化玻璃基底的具体制备方法如下：首先用铬酸将盖玻片浸泡过 夜；再依次用纯水、丙酮、乙醇和纯水超声清洗，每次l〇min ;接着以盐酸：双氧水：纯水= 1:1:1的体积比例对盖玻片进行超声活化；120 °C烘干后，将盖玻片置于装有15mL无水甲苯 和lmLGOPS的反应釜中（注意盖玻片要直立放置），95°C反应8h (硅烷化反应）；硅烷化反 应完成后，依次用甲苯、乙醇、纯水超声清洗，每次20min ;最后用氮气将盖玻片吹干，储存 备用。
[0024] 步骤⑵中，所述孵育的温度是37°C，孵育时间为12~18小时。
[0025] 步骤（3)中，所述的待测物为人肺细胞的总RNA提取物。其中，人肺细胞的总RNA 提取物的制备方法为：利用miRNA Isolation Kit试剂盒对人肺细胞（A549)的总RNA进行 提取，利用Tris-HCl缓冲液对其进行稀释后，备用。
[0026] 步骤（3)中，所述生物素化的ssDNA探针（Bio-ACAACCTACTACCTCA)的序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0027] 步骤（3)中，第一次孵育的时间为2h，第二次孵育时间为2h，第三次孵育时间为 2h〇
[0028] 步骤（3)的具体实施方法如下：首先，将1 y L人肺细胞的总RNA提取物分别加到 含0. 1，0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5和0. 6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将 待测样本分别加入制备好的四面体基底中，37°C孵育2h ;PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次 后，加入50yL bi〇-RP(0. lnM)，37°C孵育2h ;PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50yL QDs (0.1 nM)，37°C孵育2h ;PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50 y L PBS缓冲液，在 荧光